逆转录
| 货号 | 名称 | 规格 | 价格 | 操作 |
|---|---|---|---|---|
| Y3345-25 | miRNA第一链cDNA合成试剂盒(加尾法) | 25 rxns | 1000 | |
| Y3052-500UL | U6 Forward PCR Primer (for miRNA qRT-PCR) | 500 µL | 20 | |
| Y3053-500UL | Universal Reverse PCR Primer (for miRNA qRT-PCR) | 500 µL | 20 | |
| Y3347-50 | SweScript First Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR | 50 rxns | 200 | |
| Y3349-50 | SweScript Blue RT SuperMix for PCR | 50 rxns | 230 | |
| Y3356-100 | Universal One-Step RT-qPCR Kit | 100 rxns | 700 | |
| YGQ-08 | PCR-8联管压/起盖器 | 个 | 150 | |
| YT-9600 | PCR仪 | 台 | 28000 |
此处以 G3329 彩色示踪一管化一步法基因组DNA去除与逆转录试剂盒（适合qPCR） 为例
(1) 反应体系配制（推荐20 μL反应体系）；
Component | Volume |
5×SweScript All-in-One Blue RT SuperMix for qPCR | 4 μL |
gDNA Remover | 1 μL |
Total RNA/mRNA | 0.1 ng-5 μg/10 pg-0.5 μg |
Nuclease-free Water | Add to 20 μL |
(2) 轻轻混匀并离心；
(3) 逆转录程序设置：
Temperature | Time |
25℃ | 5 min |
42℃ | 15-30 min |
85℃ | 5 s |
1、以cDNA为模板，进行PCR反应的条带信号越来越弱怎么办?
解决方案：
a、可能是cDNA反复冻融造成降解，使用时可分装冻存，常用的保存在4℃，剩下的保存在-20℃；
b、也可能是酶、缓冲液、引物、PCR水等出现问题，可一步步进行排查，然后更换试剂。
2、是否推荐通过分光光度计分析cDNA浓度和纯度？
解决方案：
不推荐，因为逆转录后的cDNA是一个混合体系，主要由：cDNA、未完全逆转录的RNA、dNTP、残余的引物以及各种蛋白和盐离子等，会影响cDNA的吸光度。
3、怎么检测RNA逆转录是否成功？
解决方案：
a、内参法：通过PCR扩增内参引物，如果能扩增出来可以一定程度上保证cDNA的质量。但是不能完全保证cDNA是没有问题的，因为内参是高丰度基因，如果cDNA出现部分降解，扩增可能不受影响。
b、已知基因扩增法：如果有这个模板的已知基因被扩增出来，可以直接用该引物进行扩增验证，可一定程度上保证cDNA的质量。
4、逆转录cDNA中残留的gDNA会给后续qPCR实验带来什么影响？
解决方案：
进行qPCR扩增的时候，cDNA和gDNA会被同时扩增，此时无法确认荧光信号是来自cDNA还是gDNA，定量结果会产生偏差。特别是对于低表达量的基因，Ct值较大，更容易受到gDNA的影响。针对这种情况，可以考虑设计跨内含子的引物，或者使用DNase I处理gDNA等。推荐彩色示踪一管化一步法基因组DNA去除与逆转录试剂盒（适合qPCR）（G3329-50)
5、逆转录cDNA后，RT-(q)PCR扩增量低或未扩增？
解决方案：
a、RNA完整性低：对RNA完整度进行评估、避免反复冻融、使用RNase抑制剂等；
b、RNA纯度低：用分光光度计评估RNA纯度、重新纯化RNA等；
c、低RNA量：确保有充足的RNA样本量、灵活调整实验条件适应最低的RNA量等。