骨

常见观察部位：关节矢状纵切或者冠状纵切，观察关节软骨、骨髓、半月板、滑膜、韧带等；颅骨矢状切面和冠状切面。

此外还有各种部位的骨组织切片可以详见<赛维尔骨组织常见切面参考>或者咨询平台客服；

注意事项：

1. 切片不完整，破损，缺失等问题

取样时需要尽量轻柔，取样后需及时放入到固定液中（推荐赛维尔单支装固定液，即开即用，避免分装，节约时间），取材器械需要薄而锋利，避免挤压挫伤标本。分离骨关节时一定要先将皮肉去掉，再剪断关节处的韧带等结缔组织，再使关节分离，不可强用力掰开。

2. 取样后的样本需要及时进行固定，动物处死后最好10分钟内将骨组织取下剥皮去肉放入固定液中固定，固定液的体积是组织体积的20倍及以上，可以借助摇床缓慢摇动加快固定液的渗透。除了需要做ALP染色的样本需要4℃固定外，做其他实验样本可以常温固定。固定液液浑浊，有絮状物或呈红黑色，会影响染色结果，固定运输过程中，需要选择合适的固定容器，要保证组织在容器内不贴壁，挤压（标准：可轻晃标本瓶，看组织在容器内是否能自由移动）

3. 样本运输前，需提前确认好运输时间，避免样本固定时间过长，样本放入固定液中即可安排运输（特殊情况可与业务员进行确认），固定的样本可以常温进行运输（做ALP染色的样本需要4℃固定运输），切勿冷冻结冰；若是已经制成切片的样本，对于石蜡样本可常温运输，冰切样本需要在-20℃条件进行运输

4. 固定过程中组织被冷冻，会导致组织被冰晶破坏，染色后形成大小不等的空腔。

5. 骨组织带皮带肉固定，会使得固定液难以渗透到骨组织内部，影响固定，切片时无法切到对应骨组织结构，所以取样固定时尽量去皮去肉。

第一步：脱钙

脱钙： 骨组织做石蜡切片或冰冻切片前，需要进行脱钙，脱钙后常做石蜡切片可以进行常规的病理组织学染色，如HE染色，番红固绿染色等；除了单独研究骨组织外，一些带着骨组织的软组织在做石蜡切片前也是需要脱钙的，如滑膜，韧带，跟腱等；

常用的脱钙剂包括强酸性脱钙液和乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙液，其中EDTA脱钙液能保留大部分抗原，但脱钙时间较长。赛维尔生物搭配脱钙仪，可大大缩短脱钙时间

脱钙时间：

Tips：对于后续需要做组化荧光，原位杂交等实验的情况，推荐选择EDTA脱钙液（G1105），EDTA是一种较温和的螯合型脱钙剂，对组织结构影响最小，可以较好保存组织的某些酶类。

第二步：石蜡包埋切片

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第三步：石蜡切片染色

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染色效果展示：

实验介绍

大动物骨组织样本很难通过脱钙、石蜡切片等方式进行制片。制片前的脱钙时间非常长，且长时间脱钙会影响染色效果。可将此类硬度较高的样本不经脱钙直接进行梯度酒精脱水MMA树脂包埋成硬度很高的树脂块，结合后续的硬组织切片机配合钨钢刀片对树脂块进行切片成8-10um左右的切片再进行后续染色，不经脱钙处理的树脂包埋切片能够最大限度地保持组织原有结构和形态，不影响后期的染色和结构观察分析。

第一步：硬组织树脂包埋（硬组织切片）

将样本通过脱水浸塑等过程后，进行树脂包埋。由于组织较硬，较致密等原因，包埋剂很难渗透到组织内部，所以浸塑的时间一般都比较长，根据样本种类、大小浸塑时间半个月甚至1个多月不等；（浸塑是在4℃进行，长时间浸塑对钙黄绿素，茜素红，四环素、二甲酚橙等跟钙结合的自发荧光素影响较小）

第二步：硬组织切片

树脂包埋好的样本，使用硬组织切片机配合钨钢刀片对树脂块进行切片成8-10um左右的薄切片

第三步：硬组织切片染色

切好的硬组织切片染色前需要脱掉树脂，然后再进行各种染色

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 染色效果展示：

第四步：扫描拍照成像

硬组织切片用到的载玻片是常规的玻璃载玻片，可以进行常规的普通切片扫描和拍照

扫描项目:

拍照项目：

实验介绍

带金属植体的骨组织或者带金属植体的其他组织（皮肤、心脏，血管）以及带骨水泥，高分子硬材料的组织还有大动物的骨组织，各种牙齿等高硬度的样本基本无法通过脱钙、软化石蜡切片等方式进行制片。可将此类硬度很高的样本不经脱钙软化直接进行梯度酒精脱水树脂包埋成硬度很高的树脂块，结合后续切磨系统将树脂块通过切片磨片制备成20um左右薄而均匀的树脂片，再进行后续染色，不经脱钙软化处理的树脂包埋切片能够最大限度地保持组织和材料原有结构和形态，不影响后期的染色和结构观察分析。

第一步：硬组织分切

在做硬组织切磨片包埋前或者包埋后需要暴露切面，需要做分切处理

第二步：硬组织树脂包埋

将样本通过脱水浸塑等过程后，进行树脂包埋。由于组织较硬，较致密等原因，包埋剂很难渗透到组织内部，所以浸塑的时间一般都比较长，根据样本种类、大小浸塑时间半个月甚至1个多月不等；（浸塑是在4℃进行，长时间浸塑对钙黄绿素，茜素红，四环素、二甲酚橙等跟钙结合的自发荧光素影响较小）

第三步：硬组织切磨片

树脂包埋好的样本，通过先切后磨（打磨抛光）的方式，将样本制成20-30um左右的树脂切片

第四步：硬组织切磨片染色

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染色效果展示:

第五步：硬组织切磨片扫描拍照

切磨片用树脂载片进行制片，整张切片厚约1.6mm，无法用普通的切片扫描仪扫描成像，推荐使用赛维尔研制的扫描仪进行切磨片的扫描全景成像（GP2067），全景观察组织结构，图像更清晰，分辨率对比度更高。（注意：切磨片扫描无法扫双宽玻片和荧光，这两类样本可以选择图像拼接和共聚焦拍照成像）；

超值全套服务

切磨片步骤较多，为了方便广大客户，赛维尔推出针对各种样本切磨片的全套服务。服务内容包含样本处理的整个实验流程如：硬组织分切，硬组织树脂包埋，硬组织切磨片，硬组织切磨片染色，扫描拍照成像。（注意：目前没有关于双宽切磨片的全套服务）

透射电镜：主要用于观察细胞内部的超微结构，如细胞器、细胞膜、细胞骨架等。

扫描电镜：可以清楚看到样本表面或者内部某个截面的形貌特征。骨组织一般需观察某截面结构、骨小梁分布、骨细胞、骨髓等。

Tips

1. 骨组织及牙齿组织富含有钙质非常坚硬不易制成超薄切片，如需要观察骨组织骨细胞的超微结构需要先行EDTA脱钙液（G1105-500ML）（不建议强酸快脱，对细胞超微结构破坏较为严重）。如果组织块过大脱钙时间过长对细胞超微结构也有较大影响。所以在脱钙前需用专门的切骨机将组织分切（GP2045）成2-3mm厚的薄骨块再进行脱钙，尽量缩短脱钙时间，减少对细胞超微结构的影响。

2. 骨组织及牙齿组织富含有钙质非常坚硬，如需观察内部某一截面结构，需用在目的区域用专门的切骨机将组织分切（GP2045）成2-3mm厚的薄骨块后再进行观察，推荐赛维尔骨组织透射电镜全套服务（GP2073）。

3. 透射电镜取样要求：1-3min取目的区域的骨组织，长度不超过2cm，尽可能用工具将组织切割薄一些控制厚度在3mm左右，减少固定不好引起的实验结果不佳。取好的组织放入电镜固定液室温避光固定2h，再转移至4℃保存，4℃冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰。4℃时样本可保存1个月左右。

4. 扫描电镜取样要求：1-3min取目的区域的骨组织，长度不超过2cm，用PBS轻轻漂洗，将样本表面的血污，毛发等去掉，将需要扫描的面做好标记或写清楚观察面，放入电镜固定液室温避光固定2h，再转移至4℃保存，4℃冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰。4℃时样本可保存1个月左右。（样本在电镜取样规定大小范围内可含非磁性金属）。