常见问题及解决方案

实验步骤

问题	原因	解决方案
转化子少、或没有转化子	感受态状态不好，转化效率低	1、重新做感受态，或购买新批次感受态 2、使用感受态时避免反复冻融，温度微升对感受态都有很大的影响
	细菌复苏时间太短	热激后将感受态在培养集中留出足够时间进行复苏（时间延长至1小时）
	目的片段用量过少	适当增加目的片段用量
	目的片段质量差	确保目的片段没有反应残留物，如：限制性内切酶、盐、苯酚等残留物
	目的片段有毒性	1、若克隆的序列表达的蛋白对大肠杆菌有毒，可以选用低表达水平或者严格调控诱导的启动子；也可选用低拷贝的质粒 2、目的片段存在与大肠杆菌重复的序列，大肠杆菌不耐受目的片段的序列，可更换耐受重复序列的菌株
	抗生素用错/浓度过高	1、检查载体的抗性，确认抗生素是否用对 2、适当降低抗生素使用浓度
	连接效率低	1、若反应体系中T4连接酶过多，可能会影响连接的效率； 2、检查连接酶是否还有活性； 3、优化反应时间、温度、目的片段：载体比例
	酶切效果不理想	1、确认酶切位点是否正确 2、更换质量高的限制性核酸内切酶（点击查看推荐） 3、根据说明书，调整酶切温度、时间、缓冲液等
菌落有空载体	载体出现自连	需减少载体自连，可使用碱性磷酸酶快速去磷酸化（推荐G3400-1000U）
菌落有空载体	酶切不完全	1、更换质量高的限制性核酸内切酶（点击查看推荐） 2、根据说明书，调整酶切温度、时间、缓冲液等
不含载体	抗生素浓度过低、降解	1、确认并使用正确的抗生素用量 2、抗生素高温易失活，加入抗生素是需等待培养基冷却至55℃以下 3、可接种未转化的感受态作为阴性对照，以检测抗生素活性
	卫星菌落	有的大肠杆菌生长的很快会将抗生素快速分解，在转化株周围就会生长出很多非抗性的菌株，因此我们需要将转化株孵育时间控制在16小时以内
	转化株浓度过高	转化株密度过高会快速降解抗生素，使得无载体细胞生长，可将转化株浓度进行适当的稀释
插入片段截短	纯化时切割的胶块错误	确保条带正常分离，切割正确条带大小的胶块
插入片段截短	酶切效果不理想	1、酶切位点不唯一，检查图谱，重新选用限制性核酸内切酶 2、内切酶存在污染性核酸酶，需更换新的酶（点击查看推荐）
插入片段序列错误	插入片段突变	1、模板有误：若选取多个菌落进行检测并测序，都是相同的突变，考虑起始模板本身存在问题 2、紫外线损伤DNA：照胶时不可长时间将DNA片段暴露于紫外线下，尽量避免曝光时间