细胞复苏

细胞复苏

细胞复苏是指当需要用冻存的细胞进行研究时，将冷冻保存的细胞迅速融化，恢复其生长状态的过程

1、准备适合细胞生长的培养基，确保其无菌且预热到适宜的温度（通常为37℃），推荐使用赛维尔专用培养基（即开即用，经过多级优化，更适用于对应细胞的培养）

2、把防爆冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微振动。约1min冻存液即可融至黄豆粒大小，拿出用酒精清洁后，放到超净工作台里

3、将解冻的细胞逐滴转移到装有完全培养基的离心管内，再用完全培养基把冻存管洗一遍，将管壁上的细胞都洗下来，1000rpm，4℃，离心（推荐SLX-1024F 真低温保护；未配平监控系统更安全）5min（实际离心速度和时间取决于细胞种类）

4、把上清液倒掉，根据沉淀量选择合适的培养容器，用1mL培养基重悬沉淀，种到加有培养基的培养容器里，并前后左右轻轻摇动，使培养容器中的细胞均匀分布。

下表仅供参考，不同的细胞类型对接种密度有不同要求，请以文献资料或预实验结果为准

5、标好细胞种类，代次和日期等，放到推荐的培养环境中培养（培养环境取决于细胞和培养基类型）

TIPS：

1、建议更换培养基时采取半换方式。如：培养皿内原本是10mL完全培养基，吸弃5mL，补加5mL新鲜完全培养基。或者直接使用细胞供应商配套的完全培养基，例如在赛维尔细胞库购买的细胞，可以直接使用其配套的完全培养基，以免细胞因不适应新的培养基而导致生长滞后

2、复苏后应密切观察细胞的形态和生长状态，及时更换培养基。建议2天更换1次完全培养基。具体更换频率由实际的细胞密度决定。

1、细胞复苏后无活细胞

①细胞冻存不当：在冻存前，细胞可能因为过度生长导致接触抑制，细胞进入休眠状态，影响其复苏后的活性。长期在-80℃下冻存细胞，也可能会导致细胞内冰晶的重新结晶，损伤细胞膜和细胞器，影响细胞的活性，应该新取一只冻存细胞，并储存在液氮中。将细胞储存在液氮中，直至复苏。

②自行制备的解冻细胞无活性：将细胞按照推荐的密度冻存；制备冻存细胞时使用传代次数少的细胞；新取一只冻存细胞重新操作

③复苏培养基使用不当：使用配套的培养基，确保培养基使用前已经预热；

④细胞稀释过度：将解冻后的细胞按照推荐的高密度接种，以改善复苏效果

⑤处理细胞时动作不够轻柔：冻存和复苏过程对大多数细胞都会造成不利影响。不要通过涡旋振荡或者用力敲打培养瓶的方法使细胞脱落（培养昆虫细胞时除外），也不要高速离心细胞

2、细胞生长缓慢

①生长培养基使用不当：使用配套的培养基，确保培养基使用前已经预热；

②细胞传代次数过多：使用传代次数较少的健康细胞

③细胞生长超过汇合状态：哺乳动物细胞传代应在细胞处于对数期、未达到汇合状态时进行

④细胞被支原体污染：用支原体检测试剂，查找原因。如果确诊是支原体污染，则用支原体清除试剂，在确保支原体清除之后，再继续进行细胞培养实验。养细胞时，可以使用支原体预防试剂，干扰支原体的DNA复制和蛋白质合成，防患于未然。