蛋白定量

目前最常用的蛋白浓度定量检测方法有两种，即Bradford法和BCA法。可以根据样品的特性（如样品中是否含有螯合剂或去垢剂）、实验条件（检测波长），选择合适的蛋白定量试剂盒。以BCA蛋白定量检测试剂盒为例，当蛋白浓度在50-2000 μg/mL浓度范围内有较好的线性关系。

取适量蛋白提取步骤中未变性的总蛋白溶液，使用 BCA 蛋白定量检测试剂盒（G2026-200T）测蛋白浓度，蛋白浓度测定方法如下：

1.  配制蛋白标准贮备液

   取1 mL蛋白标准配制液加入到蛋白标准品（BSA）蛋白标准管中，将25 mg蛋白标准品完全溶解，即得到浓度为25 mg/mL的蛋白标准贮备液。配制成的蛋白标准溶液可-20℃长期保存。

   Tips：确保样品稀释适当，避免过高的蛋白浓度影响测定结果。        

2. 配制蛋白标准工作液

   配制蛋白标准工作液：取适量25 mg/mL蛋白标准贮备液，用PBS或生理盐水（G4702-500ML）稀释50倍，得到终浓度为0.5 mg/mL的蛋白标准工作液。注意稀释时按照10倍梯度方法稀释，确保稀释准确。

3. 绘制标准曲线（酶标仪法）

   将蛋白标准工作液分别按0，1，2，4，8，12，16，20 μL加到96孔板（ESP-96-D）中，然后用PBS或生理盐水依次加20，19，18，16，12，8，4，0 μL将上述梯度工作液补足到20 μL。得到蛋白浓度依次为0，25，50，100，200，300，400，500 μg/mL的梯度曲线。

4. 准备待测样品

   将待测的蛋白样品进行适当稀释（可通过预实验检测，使样品蛋白浓度在标准曲线范围内，确保检测结果可信），按照每个样品20 μL的量加到96孔板中。待测样品与蛋白标准品用相同溶液稀释。

5. 配制BCA显色工作液

   将BCA试剂与硫酸铜溶液按照50:1体积比充分混合均匀，得到BCA显色工作液。BCA显色工作液可室温保存，24 h内使用。每个待测样品需200 μL，建议按需配制，避免浪费。

6. 检测

   向标准曲线样品孔及待测样品孔中每孔加入BCA显色工作液200 μL，充分混匀（可将96孔板放在振荡器上振荡30 s），37℃反应30 min后，以标准曲线0号做参比，在562 nm波长下比色测定，记录各孔吸光度值。（注：也可以在室温反应2 h，或60℃反应30 min。如果蛋白浓度较低，建议置于60℃反应）

7. 计算

   以标准曲线中梯度蛋白含量（μg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应孔中待测样品的蛋白浓度（μg/mL），再乘以样品稀释倍数即为待测样品实际蛋白浓度。

Bradford法和BCA法，分别受到待测样本中哪些物质的影响？