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电泳制胶

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实验步骤

制备的蛋白样本通过聚丙酰胺凝胶按分子量大小电泳分离。可以根据凝胶体系、蛋白分子量大小、凝胶配置方法选择合适的制胶试剂盒。

表2:制胶试剂盒选择指南

货号名称凝胶体系搭配缓冲液分离范围制胶方法
G2193-50T一步法手动梯度PAGE彩色凝胶快速配制试剂盒Tris-GlycineG2193-5-20L8-320kDa无需液封、无需等待下层胶凝固,可直接加入上层胶,15min制好胶

G2175/G2176/G2177

/G2178/G2179

一步法PAGE彩色凝胶超快速配制试剂盒Tris-Glycine

G2081/G2149/

G2152/G2018/

G2027/G2144/

G2162

10-300 kDa(6%/8%/10%/12%/15%)无需液封、无需等待下层胶凝固,可直接加入上层胶,15min制好胶
G2302/G2306Tris SwePAGE预制胶(11孔)Tris-Glycine

G2081/G2149/

G2152/G2018/

G2027/G2144/

G2162

10-300 kDa(4%-12%/10%)即开即用,无需配胶

G2041/G2042/G2043/

G2044/G2045

PAGE彩色凝胶超快速配制试剂盒Tris-Glycine

G2081/G2149/

G2152/G2018/

G2027/G2144/

G2162

10-300 kDa(6%/8%/10%/12%/15%)A液+B液 1:1混合即可,上层胶红色/绿色可选

G2066/G2067/G2068

G2171/G2172/G2173

PAGE高分辨彩色(红色/绿色)凝胶超快速配制试剂盒Bis-TrisG2051/G205010-250 kDa(8%/10%/12%)A液+B液 1:1混合即可,上层胶红色/绿色可选
G2003SDS-PAGE凝胶制备试剂盒Tris-Glycine

G2081/G2149/

G2152/G2018/

G2027/G2144/

G2162

10-300 kDa可配置任意浓度凝胶,通过凝胶浓度计算各试剂添加量
G2037SDS-PAGE 凝胶快速制备试剂盒Tris-Glycine

G2081/G2149/

G2152/G2018/

G2027/G2144/

G2162

10-300 kDa可在短时间内配置任意浓度凝胶,通过凝胶浓度计算各试剂添加量
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G2081/G2149/

G2152/G2018/

G2027/G2144/

G2162

4-20%任意浓度梯度胶、等度胶制胶仪(T-20 PLUS配套试剂)



详细步骤:

1. 清洗玻璃板

用洗涤剂清洗玻璃板(G6052-1.0T),清水冲洗两次,再用纯水(G4701-500ML)漂洗一次,斜放在多彩电泳玻璃板沥水架(TR-001)上,自然晾干或者烘干;

Tips:水印可能会干扰蛋白质的迁移,导致条带的变形或模糊,影响结果的准确性,玻璃板斜放晾干更快,底部不留水印。

 

2. 配制分离胶和浓缩胶

根据目标蛋白分子量大小,选择赛维尔一步法PAGE彩色凝胶超快速配制试剂盒(表2)。

Tips1:试剂盒恢复室温后再使用,降低凝胶过程产生气泡的可能性。

表2:不同浓度PAGE下层胶(分离胶)的最佳分离范围

PAGE分离胶浓度最佳分离范围(kDa)(Tris-Glycine电泳缓冲液,G2018)最佳分离范围(kDa)(SWE快速高分辨电泳缓冲液,G2081)
6%50-30015-300
8%30-13010-250
10%20-1005-150
12%10-603-100
15%<40<60

根据实验需求,等比例混合溶液A和B,分别配制下层胶溶液、上层胶溶液。然后准确吸取上层胶彩色染料,加入凝胶液中,混匀。灌胶前加入适量的改良型促进剂。不同规格以及不同厚度的玻璃板可以等比例调整上层胶和下层胶溶液的配制体积,以常用规格8.3 cm×7.3 cm凝胶板(单块)为例,推荐配制体系如下表格:

配制组别组分0.75 mm玻璃板1.0 mm玻璃板1.5 mm玻璃板
下层胶溶液10%下层胶溶液A2 mL2.5 mL4 mL
10%下层胶溶液B2 mL2.5 mL4 mL
改良型促凝剂24 μL30 μL48 μL
上层胶溶液上层胶溶液A1 mL1 mL1.5 mL
上层胶溶液B(红色)1 mL1 mL1.5 mL
改良型促凝剂12 μL12 μL18 μL
上层胶染料(红色或绿色)4 μL4 μL6 μL

装配好凝胶制具,向两块玻璃板中间胶室中缓慢注入配制好的下层胶溶液至胶室的2/3到3/4处(根据实际实验需求来定),直接加入配制好的上层胶溶液,插入梳子,待其凝固(约10-15min)后即可使用

Tips2:WB配制凝胶时,上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)加入的量过多或者过少,都会影响蛋白质的迁移和分辨率,最终影响实验结果。赛维尔电泳玻璃板G6052-1.0T,全部加带刻度线,按刻度线制胶,将下层胶加至刻度线处,再加入上层胶,不会出错。



Tips3:梯度胶具有分辨率高、分离效果好、适用范围广的特点,可以使用赛维尔一步法手动梯度PAGE彩色凝胶快速配制试剂盒(G2193-50T)配制梯度PAGE凝胶,一个试剂盒,大/中/小分子量蛋白都能有效分离。如果梯度胶需求量比较大,可以使用赛维尔制胶仪(T-20 PLUS)搭配大通量制胶器(BVE-V10),能够批量配制4-20%各种浓度梯度胶、等度胶,只需简单设置参数,仪器自动配胶、一键灌胶、自动清洗。



   


常见问题
  1. 玻璃板与胶之间或者是胶里面有气泡?

    玻璃板和胶之间有气泡:

    1、玻璃板没有清洗干净,建议玻璃板用洗洁精清洗干净后纯水冲洗;

    2、制胶器本身的缘故,拆胶时容易产生气泡,拆胶时应小心,拔梳子时不要左右晃动;

    胶里面有气泡:

    1、胶凝固是一个放热的聚合反应。温度越低,液体中溶解的气体越多,凝胶过程会有很多气泡产生。建议将凝胶试剂盒从冰箱取出先平衡至室温;

    2、灌胶时移液器冲击力大有气泡,拿整个制胶器放桌子上震两下,让里面的气泡浮上来。

 

  1. 制备SDS-PAGE凝胶,30分钟胶也没凝

    1、温度对于胶的凝固时间影响较大。为保证实验顺利进行,一般温度越低,凝固时间越长,可适当增加改良型促凝剂用量;温度越高凝胶越快,可适当减少改良型促凝剂用量;

    2、制胶时各组分要充分混匀,最好放在涡旋仪上混匀;

    3、改良型促凝剂反复冻融可能会失效。改良型促凝剂相较于过硫酸铵(AP)稳定性更好,使用时拿出一支,使用结束后于4℃保存,以便后续常规使用,可保存六个月;若长期不用请放置于-20℃保存,避免反复冻融;

 

  1. 使用制胶试剂盒制胶,加样时胶孔里有残胶的原因?

    可能原因:

    梳子和玻璃板不匹配,梳子太松了;

    胶凝的速度太快,浓缩胶没凝好。

    解决办法:

    选择匹配的梳子,另外梳子用的时候太久也会变薄,需要定时更换梳子;

    降低改良型促凝剂的用量,让胶凝的慢一些。


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