规格 TSA荧光双重染色试剂盒 G1235-100T 100T 产品简介 本产品TSA荧光双重染色试剂盒，适用于石蜡切片免疫荧光双重染色，尤其适用于相同来源一抗的双重荧光免疫标记，也可用于不同来源抗体的双重荧光免疫标记。主要原理是基于酪胺信号放大（TSA，Tyramide signal amplification），以下简称TSA技术。TSA技术主要原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应（即荧光标记的酪胺盐在HRP催化H 2 O 2 下形成共价键结合位点），产生大量的酶促反应，该产物能与周围的蛋白残基（包括色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基）结合，在抗原-抗体结合部位形成大量的荧光素沉积，实现信号放大。还可以通过多次重复免疫标记，使用不同的荧光酪胺实现多重荧光染色。 TSA系列荧光染色试剂盒相关荧光染料的 荧光光谱数据如下： 荧光染料类型 Ex/Em FITC-Tyramide 492/518 CY3-Tyramide 555/569 iF488-Tyramide 491/516 iF555-Tyramide 557/570 iF647-Tyramide 656/670 储存与运输 试剂盒内各组分按各自所需条件保存，冰袋（wet ice）运输。6个月有效。 组成 Component Number Component G1235-100T S torage G1235-1 FITC-Tyramide 50 μL -20℃ G1235-2 CY3-Tyramide 50 μL -20℃ G1235-3 Tyramide稀释液 100 mL 4℃ G1235-4 DAPI（即用型） 20 mL 4℃ G1235-5 组织自发荧光淬灭剂（苏丹黑） 20 mL 室温 G1235-6 抗荧光淬灭封片剂 10 mL -20℃ 说明书 1份 实验前准备： 1. 自备0.01 mol/L PBS缓冲液（pH7.0-7.4，可购买 G4202 或 G0002 ），3% H 2 O 2 和0.3% H 2 O 2 ； 2. 自备一抗及相应HRP标记二抗，抗原修复液（根据抗体及组织类型选择合适的抗原修复液）； 3. 根据用量，按照下表比例配制 TSA染色工作液。 TSA染色工作液 试剂名称 体积 TSA-FITC染色工作液 Tyramide稀释液 1 mL 0.3% H 2 O 2 10 μL FITC-Tyramide 2 μL TSA-CY3染色工作液 Tyramide稀释液 1 mL 0.3% H 2 O 2 10 μL CY3-Tyramide 2 μL 注： 荧光Tyramide融化后离心机短时离心，干净吸头吹吸混匀后取用。TSA 染色工作液 建议现配现用， 需4℃避光保存，24 h内有效 。 操作步骤 以组织切片为例，以下实验步骤中的实验用水均为纯水： 1. 组织切片脱蜡至水； 2. 抗原修复：根据所使用的一抗及样本类型，采用合适方式对组织切片进行抗原修复。PBS清洗3次，每次5 min； 3. 用免疫组化笔对组织画圈标记； 4. 灭活内源性过氧化物酶：向切片上滴加3% H 2 O 2 覆盖组织，室温避光孵育25 min，阻断内源性过氧化物酶，以减少非特异性背景染色。PBS清洗3次，每次5 min； 5. 封闭：切片水分稍微甩干后，向组织上滴加3%BSA或血清封闭30 min，具体根据一抗及二抗种属决定封闭试剂； 6. 一抗孵育：用PBS（或其他抗体稀释液）将一抗稀释至适当浓度。轻轻甩掉切片上的液体，滴加稀释好的一抗覆盖组织，切片平放于加水的湿盒内4℃孵育过夜。PBS清洗3次，每次5 min； 7. 对应HRP二抗孵育：用PBS（或其他抗体稀释液）将二抗稀释至适当浓度，向组织上滴加二抗，室温孵育50 min。PBS清洗3次，每次5 min； 8. 向组织上滴加 50- 100 μ L TSA-FITC 染色工作液 确保完全覆盖组织，室温避光孵育10 min。PBS清洗3次，每次5 min； 9. 微波处理：组织切片置于盛满抗原修复液（根据组织类型及抗体选择合适的抗原修复液）的修复盒中进行微波加热处理，去除已经结合的一抗二抗。（微波建议的时间和温度：加热到95摄氏度以上，维持15分钟）此步骤中需防止液体过度蒸发导致的干片。 10. 重复步骤6，进行第二个一抗的孵育：用PBS（或其他抗体稀释液）将需检测的第二个抗体（一抗）稀释至适当浓度。轻轻甩掉切片上的液体，滴加稀释好的抗体覆盖组织，切片平放于加水的湿盒内4℃孵育过夜。PBS清洗3次，每次5 min； 11. 重复步骤7，进行对应HRP二抗孵育：用PBS（或其他抗体稀释液）将二抗稀释至适当浓度，向组织上滴加二抗，室温孵育50 min。PBS清洗3次，每次5 min； 12. 向组织上滴加 50- 100 μ L TSA-CY3 染色工作液 确保完全覆盖组织，室温避光孵育10 min。PBS清洗3次，每次5 min； 13. 细胞核复染DAPI：切片稍甩干后在组织上滴加 DAPI （ 即用型 ） 染色液，避光室温孵育10 min。PBS清洗3次，每次5min。 14. 组织自发荧光淬灭（可选）：向组织上滴加 组织 自发荧光淬灭剂B液 ，室温孵育5 min，流水冲洗3 min。 15. 封片及镜检：切片稍甩干后滴加 抗荧光淬灭封片剂 封片。荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察并采集图像。切片置于避光切片盒内4℃可保存15天。 注意事项 1. 与荧光二抗相比，TSA试剂盒有更高的灵敏度和更强的信号。因此一抗使用浓度需降低， 一般在抗体说明书建议的稀释比基础上再扩大5-10倍， 以减少非特异性结合导致的背景荧光。建议设置一抗梯度浓度获得最佳效果。 2. 如背景荧光较强，建议增加组织自发荧光淬灭步骤。 3. 荧光Tyramide的建议稀释比是1:500，可根据实验结果调整稀释比例（ 调整 范围1:200 - 1:1000）。 4. 如进行多重荧光标记，建议先孵育多抗，后孵育单抗； 先孵育高丰度目的蛋白对应的抗体，再孵育低丰度目的蛋白对应的抗体 。 本产品仅供科研用途，不用于临床诊断！ （产品包装升级中，以实物为准。 ）