GF009-50T RNASweAMI TM 原位杂交DAB信号检测试剂盒（无探针） b 组成及储存条件 Component No. Component name GF009-50T Size Storage G3702-15UL anti-DIG (HRP) 15 μL -20℃ G3708-100ML 固定液 100 mL 4℃ G3709-50ML 修复液（20×）（pH 6.0） 50 mL 4℃ G3710-1ML Proteinase K 1 mL -20℃ G3711-20ML 通透剂 a 20 mL 4℃ G3712-50ML 杂交液 50 mL 4℃ G3713-100ML 20×SSC 300 mL 4℃ G3716-10ML 封闭液 10 mL 4℃ G3717-100UL DAB显色剂A 100 μL 4℃ G3718-10ML DAB显色剂B 10 mL 4℃ a 通透剂有效成分为0.5% Triton X-100，针对不同的细胞可进行调整，如需更低浓度的Triton X-100通透处理细胞，可用无核酸酶的1×PBS对通透剂进行稀释后使用。 b 整套试剂可以用于检测50个面积约为20 mm×20 mm的组织点，当用于检测的样本面积较大时，每套试剂能完成的实验次数会相应减少。 RNA SweAMI 原位杂交简介 原位杂交（In situ hybridization），即ISH技术，基本原理是基于碱基互补配对原则，利用特定标记（如荧光素、地高辛等）的已知序列单链核酸作为探针，与待检测的细胞或组织切片中的靶基因（DNA或RNA）特异性结合，二者经碱基互补配对，形成靶基因与标记探针的杂交体。随后根据探针的标记物，利用不同的显色系统对杂交体进行显色及信号放大，从而对靶基因进行精确定量定位。根据探针的标记物不同，有荧光显色系统、DAB显色系统等。 RNASweAMI ISH原位杂交技术检测流程如图1所示，特异性的寡核苷酸探针通过碱基互补配对原则与组织样本中的靶标RNA杂交，然后通过两个“L”型结构（单链DNA）使得靶标处富集大量的信号探针，实现级联式信号放大，经明场或者荧光成像技术，可观察到靶标RNA处形成的明显点状或团簇状信号。相比于传统的原位杂交直标方法，该方法理论上可以将信号放大400-8000倍，实现单分子RNA的可视化，且具有很高信噪比。 本手册提供使用RNASweAMI原位杂交实验所需的特异性靶标探针 （根据用户指定的基因提前设计及合成） ，地高辛标记的信号探针以及DAB信号检测试剂盒的指南和实验方案。 用户自备材料 （ 见下表1所示 ） 表 1 材料名称 推荐供应商或试剂级别或特征 货号 双氧水（30% H 2 O 2 ） 分析纯 —— 无水乙醇 分析纯 —— 二甲苯 分析纯 —— 中性树胶 Servicebio WG10004160 超净快干封片胶 Servicebio G1404 苏木素染液 Servicebio G1004 苏木素分化液 Servicebio G1039 苏木素返蓝液 Servicebio G1040 1×PBS，无核酸酶 Servicebio G4202 无核酸酶水 Servicebio G4700 抗原修复盒 Servicebio WGXFHA0008 24片染色架/载玻片架 Servicebio WG493-24 免疫组化笔 Servicebio G6100 湿盒 Servicebio WG525 无酶离心管（各种规格） Servicebio 无酶吸头（各种规格） Servicebio 杂交仪 —— —— 水浴锅 可维持室温至100±1℃ 经RNase灭活处理的器皿* 玻璃烧杯，玻璃瓶 —— * 重要： 所有用于原位杂交检测的试剂配制，需要用无酶耗材（各种规格的离心管，吸头等）以及经RNase灭活处理的器皿（例如玻璃烧杯，玻璃瓶等）。关于器皿的RNase灭活处理，可采用以下方法： RNase灭活方法一：推荐使用专用的RNase灭活液（推荐 G3031 ，RNase灭活液(25×)），用无核酸酶稀释至1×，将玻璃烧杯、玻璃瓶以该溶液浸泡，然后置于60℃条件下孵育10 min进行RNase灭活。取出玻璃器皿，控干液体后即可用于本实验中各种试剂的配制。RNase灭活液可反复使用，具体使用方法可参见官网产品说明书。 RNase灭活方法二：使用DEPC灭活RNase。配制含0.1%DEPC的纯水，将需要处理的玻璃器皿以该溶液浸泡过夜后，取出玻璃容器，控干液体，然后将玻璃器皿进行121℃高温灭菌20 min。即可得到RNAse灭活的器皿，用于本实验中各种试剂的配制。 1 实验前准备 1.1 实验流程概览 1.2 试剂准备 (1) 配制3% H 2 O 2 ：将双氧水（30% H 2 O 2 ）用无核酸酶水稀释至3%，即每1 mL双氧水与9 mL无核酸酶水混匀。 (2) 配制 1×修复液 ：将 修复液（20×）(pH 6.0) 用无核酸酶水稀释20倍，即1 mL修复液（20×）与19 mL无核酸酶水混匀。 (3) 配制 Proteinase K工作液 ：将 Proteinase K 用1×PBS稀释10倍，即每100 μL Proteinase K与900 μL 1×PBS混匀，得到Proteinase K工作液。 (4) 配制靶标探针混合物1杂交液： 靶标探针混合物1 用 杂交液 稀释5倍。 (5) 配制靶标探针混合物2杂交液： 靶标探针混合物2 用 杂交液 稀释5倍。 (6) 配制 DIG 信号探针杂交液 ：将 DIG probe（200×） 用杂交液稀释200倍，即每1 μL DIG probe（200×）与199 μL杂交液混匀。 (7) 配制 anti-DIG（HRP）工作液 ：将 anti-DIG (HRP) 用1×PBS稀释400倍，即每1 μL anti-DIG (HRP)与399 μL 1×PBS混匀。 (8) 配制 DAB显色液 ：将 DAB显色剂A 与 DAB显色剂B 按照1:50体积比混匀，得到DAB显色液。注意，此溶液需现配现用。 (9) 配制2×SSC：将 20×SSC 用无核酸酶水稀释10倍，即每1 mL 20×SSC与9 mL无酶水混匀。 (10) 配制1×SSC：将 20×SSC 用无核酸酶水稀释20倍，即每1 mL 20×SSC与19 mL无酶水混匀。 (11) 配制0.5×SSC：将 20×SSC 用无核酸酶水稀释40倍，即每1 mL 20×SSC与39 mL无酶水混匀。 (12) 配制0.1×SSC：将 20×SSC 用无核酸酶水稀释200倍，即每1 mL 20×SSC与199 mL无酶水混匀。 2 样本前处理 2.1 组织石蜡切片 (1) 脱蜡复水： 制备好的组织石蜡切片（3-5 μm）依次进入二甲苯I 15 min-二甲苯II 15 min-无水乙醇Ⅰ5 min-无水乙醇Ⅱ5 min-85%乙醇5 min-75%乙醇5 min-无核酸酶水。 (2) 热 修复 ： 1×修复液 置于抗原修复盒内，将组织切片浸没于1×修复液中，将抗原修复盒置于提前加温至100℃的水浴锅内，继续保温至1×修复液沸腾并维持15 ...