In-Cell Western™ 操作方法

A.     所需溶液和试剂

注意：所有溶液用Milli-Q或相当级别的水配制。

1. 10 X磷酸盐缓冲液（PBS）：在800 ml水中加入80 g 氯化钠（NaCl），2 g 氯化钾（KCl）14.4 g磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）and 2.4 g 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）。调节pH到7.4，定容至1 L。
2. 甲醛溶液，16%，无甲醇的类型，Polysciences, Inc. (cat# 18814)，现配现用。开封以后放在4°C避光保存。使用时用PBS稀释。
3. 封闭缓冲液：配制25 ml时，2.5 ml 10 X PBS和1.25 ml正常血清（来源与二抗相同，例如正常山羊血清，正常驴血清）加入到21.25 ml的蒸馏水中，混匀。边搅拌边加入75 µL Triton X-100 (100%)。
4. 抗体稀释缓冲液：配制40 ml时，取4 ml 10 X PBS加入36 ml蒸馏水，混匀。加入0.4 g BSA，混匀溶解。边搅拌边加入120 µL Triton X-100 (100%)。
5. 荧光素标记的二抗。

注意：不论是一抗还是荧光素标记的二抗，第一次使用时都需要做滴定分析，以判断何种稀释比例可以在目的样品上得到最强的特异信号，同时背景最低。

B.      固定和免疫标记

注意：以下的固定方法对大多数抗体和细胞系都适用。但是我们建议实验前尝试不同的固定方法以找到适合所用抗体和细胞的最佳固定方法。

注意：细胞应当直接在多孔板中培养，处理，固定和染色。

注意：为避免细胞在细胞培养孔中的不均匀分布，将培养板先在室温下静置1小时，然后再放到37°C培养箱中。（详见Lundholt BK, Scudder KM, Pagliaro L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 2003 8, 566–70)。

注意：为避免散射光造成的假信号和背景荧光，请使用黑色壁的多孔板（如BD Falcon, cat# 353948）

注意：避免移液器或真空吸嘴触碰到培养孔内部，因为这些接触会在后面的定量过程中造成假象。需要弃净培养基时，将板倒扣，用力在废液缸上剧烈甩动倒掉残余培养基，然后用干净纸巾吸干。

注意：以下操作中的试剂用量是针对96孔板设计的。如需用更大或更小的孔板时，请相应调整体积。

1. 按实验所需在多孔板中培养和处理细胞。
2. 每个孔中加入50 µl用PBS配制的4%不含甲醇的甲醛溶液。
3. 室温固定15分钟。
4. 将板倒扣在醛类废液缸上，用力甩掉残余液体，然后用干净纸巾吸干。
5. 用常温PBS清洗3次，每次5分钟，每孔100 µl。
6. 加入封闭液，每孔50 µl。室温封闭1小时。
7. 在封闭时，按说明书推荐比例，用免疫荧光用（IF-IC）抗体稀释液稀释一抗。

8. 甩掉封闭液，加入一抗，每孔50 µl。

注意：在做双标记实验室时，将小鼠和兔的一抗按各自合适的比例加入到抗体稀释缓冲液中配成混合液。

9. 盖上盖子， 4°C孵育过夜
10. 用PBS洗板3次，每次5分钟。
11. 按照1:800比例用抗体稀释液稀释荧光素标记的二抗*。每孔中加入50 µl，室温下避光孵育1小时。

注意：在做双标记实验时，将抗小鼠和抗兔的荧光素标记的二抗按各自合适的比例加入到抗体稀释缓冲液中配成混合液。

12. 用PBS清洗3次，每次5分钟。
13. 作为细胞计数对照，按照1:1000用PBS稀释DRAQ5®，每孔加50 µl标记细胞核。扫描前室温至少避光孵育30分钟。

注意：为得到最佳的分辨率，扫描前弃净DRAQ5®，用PBS漂洗一次，弃净。

14. 按照厂商说明对板进行扫描。（扫描前将板底部用纸巾擦拭干净）

*推荐二抗：

抗兔：

Anti-Rabbit IgG (H+L) (DyLight® 680 Conjugate) #5366

Anti-Rabbit IgG (H+L) (DyLight® 800 Conjugate) #5151

抗小鼠：

Anti-Mouse IgG (H+L) (DyLight® 680 Conjugate) #5470

Anti-Mouse IgG (H+L) (DyLight® 800 Conjugate) #5257