成功完成Western Blot检测，必须满足4个条件：
1. 凝胶洗脱 ：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析
2. 吸附到膜上 ：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析
3. 处理期间仍截留在膜上 ：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上
4. 处理过程中可接近 ：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测
成功进行WB检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：
• 阳性对照 ：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率
• 阴性对照 ：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性
• 二抗对照 ：不加一抗，用于检测二抗的特异性
• 内参对照 ：检测标本的质量和二抗系统
• 空白对照 ：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果
WB 检测基本过程
1 、获取细胞或组织裂解物
1) 根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer：
|
蛋白位置
|
推荐buffer
|
|
全细胞
|
NP-40 or RIPA
|
|
胞浆（可溶性蛋白）
|
Tris-HCl
|
|
胞浆（骨架结合蛋白）
|
Tris-Triton
|
|
膜蛋白
|
NP-40 or RIPA
|
|
核蛋白
|
RIPA or 核蛋白提取试剂盒
|
|
线粒体蛋白
|
RIPA or 线粒体分离试剂盒
|
亦可购买商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量
2) 选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！
2 、蛋白定量
常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白
3 、电泳分离蛋白质
根据待测蛋白状态确定电泳条件：
|
待测蛋白状态
|
凝胶条件
|
上样buffer
|
电泳buffer
|
|
Reduced - Denatured
|
还原，变性
|
含β-巯基乙醇或DTT，含SDS
|
含SDS
|
|
Reduced - Native
|
还原，不变性
|
含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS
|
不含SDS
|
|
Oxidized - Denatured
|
不还原，变性
|
不含β-巯基乙醇或DTT，含SDS
|
含SDS
|
|
Oxidized - Native
|
不还原，不变性
|
不含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS
|
不含SDS
|
根据待测蛋白分子量大小确定凝胶浓度
|
蛋白分子量（kDa）
|
凝胶浓度（％）
|
|
4-40
|
20
|
|
12-45
|
15
|
|
10-70
|
12.5
|
|
15-100
|
10
|
|
25-200
|
8
|
4 、转膜
根据不同的检测目的和待测蛋白的特性，选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有：PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高。各种膜的技术参数及比较如下：
|
|
PVDF 膜
|
NC 膜
|
尼龙膜
|
|
灵敏度和分辨率
|
高
|
高
|
高
|
|
背景
|
低
|
低
|
较高
|
|
蛋白结合能力
|
100-200ug/cm2 （适用于SDS存在时与蛋白结合）
|
80-100ug/cm2
|
>400ug/cm2
|
|
机械强度
|
强
|
干的膜易脆
|
软而结实
|
|
溶剂抗性
|
强
|
差
|
差
|
|
使用前是否需要浸润
|
100% 甲醛润湿
|
缓冲液润湿
|
缓冲液润湿
|
|
适用染色方法
|
胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰
|
胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁
|
不能用阴离子染料
|
|
适用检测方法
|
显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测
|
显色法、化学发光、荧光、放射性
|
显色、化学发光、放射性
|
|
适用范围
|
普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测
|
普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。0.1um膜适用于7kDa以下蛋白
|
低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用
|
|
价格
|
高
|
较低
|
低
|
5 、封闭
去掉膜上多余的非特异性结合位点，降低背景。常用的封闭溶液有：含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS
6 、一抗孵育
一抗的选择成功与否，是整个WB实验成功的关键：选择一抗有以下几个注意点：
• 选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证）
• 选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证）
• 选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体
一抗的保存和使用：
• 根据说明书的要求条件进行抗体的保存；一般需要将抗体分装后放入-20度保存，绝对避免反复冻融。
• 抗体的工作液最好现配现用，在4度保存最好不要超过2周
• 根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。由于实验室条件和检测方法等的差异，说明书推荐的稀释比例只作参考，需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测，然后选择信噪比最好的抗体浓度进行实验。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:100-1:3000）。
• 孵育条件：推荐4°C孵育过夜（一般大于18个小时），根据抗体亲和力不同孵育时间有所区别
内参的选择和使用：WB过程监测以及目的蛋白定量的标准！
WB 常用内参及其技术参数：
|
内参名称
|
分子量大小
|
适用范围
|
|
beta-actin
|
43kDa
|
胞浆和全细胞
|
|
GAPDH
|
30-40kDa
|
胞浆和全细胞
|
|
Tubulin
|
55kDa
|
胞浆和全细胞
|
|
VCDA1/Porin
|
31kDa
|
线粒体
|
|
COXIV
|
16kDa
|
线粒体
|
|
TBP
|
38kDa
|
细胞核
|
详情请参考 “Loading Control–WB 不可或缺的武器”
7 、二抗孵育
根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:1000-1:20000）。孵育条件一般为室温1-2小时
8 、底物孵育
选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光，灵敏度高且背景低，节省抗体用量
9 、结果分析和检测
凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片
Note ：从封闭开始，每步之间都需要用TBST进行洗涤，3次，每次5min
|
