TUNEL检测细胞凋亡原理
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 检测细胞凋亡的原理。
Degradation of nuclear DNA can be examined by the TUNEL assay. This method is based on the enzymatic labeling within the cell of free 3'-OH groups at the ends of nicked DNA and the blunt ends of broken double-stranded DNA with fluorescein-labeled deoxyuridine.
Protocol for FACS
试剂配置：
1. PBS
2. 甲醛, 0.1% in PBS (6.25 ml 16%甲醛＋90 ml水) prepare just before use.
3. EDTA, 20 mM, pH 8.0
4. 0.1% Triton X-100/BSA/PBS
PBS 5 ml
Triton X-100 5 ml 0.2%
BSA 50 mg
5. PI 500 μg/μL
PI/RNase A/PBS
TUNEL检测细胞凋亡实验流程
1. 3×106 cells, 离心，10 min, 4 ℃, 300 g
2. 0.5 ml PBS重悬
3. 5 ml 1％甲醛固定，4℃, 20 min，将细胞逐滴加入乙醇
4. 离心，小心用5 ml PBS重悬
5. PBS wash once
6. 0.5 ml PBS重悬
7. Fixed in 5 ml 75%冷乙醇over night，－20℃预冷，将细胞逐滴加入乙醇，－20℃可保存一周。
8. 离心，10 min, 4 ℃, 300 g，5 ml PBS wash very gentle twice
9. 1 ml PBS重悬，移入1.5 ml褐色离心管，从此避光操作。
10. 离心，10 min, 4 ℃, 300 g，收集细胞，用80 μl Equilibration Buffer重悬，5 min，室温。
11. Make reaction system: Equilibration Buffer 45 μl、d-UTP-FITC 5 μl、TdT Enzyme 1 μl。(For one test).
12. 离心，10 min, 4 ℃, 300 g，用50 μl Reaction system重悬，incubate at 37 ℃，水浴60 min。Shake tubes every 15 min.
13. 1 ml:20 mM EDTA终止反应，Vortex混匀，离心收集细胞。
14. 1 ml 0.1% Triton X-100+BSA+PBS, wash twice. 离心收集细胞.
15. 0.5 ml PI+RNase A+PBS重悬，室温放置15－30 min，in dark.
16. FACS。FL1＋FL2。Setup negative and positive control sample.
Protocol for 组织切片 (In Situ Cell Death Detection)
1. 石蜡切片脱蜡(Dewax)，复水(Rehydrate):
Incubate slides, 55°C, 30 min.
Xylenes (二甲苯), 2 times, 2 min. each
100% EtOH, 2 times, 2 min. each
95% EtOH, 2 times, 2 min. each
80% EtOH, 2 min.
75% EtOH, 2 min.
50% EtOH, 2 min.
2. dH2O rinse.
3. Permeabilise tissue: 21－37℃，蛋白酶K工作液中孵育15－30 min（视组织类型不同而选择）,Solution must be pre-incubated for 30 mins at 37 degrees before use.
（替代方法：可以在渗透液中孵育8min）
（PK工作液：10-20ug/ml溶于10mM Tris-Cl，pH7.4-8，不含核酸酶；渗透液：0.1％TritonX-100＋0.1％柠檬酸钠，现用现配）
4. PBS洗2次
5. 准备末端转移酶工作液（现用现配, ON ICE）。
6. 滴加末端转移酶工作液，覆盖parafilm，37℃于湿盒中孵育60 min（暗处放置）（阴性对照只加酶缓冲液）
7. PBS洗3次
8. 加AP标记的抗的高辛抗体37℃湿盒中孵育30min
9. PBS清洗3次
10. 加入底物NBT/BCIP
11. 15－25℃孵育10min显色
12. PBS清洗3次
13. 复染之后，封片，（封片使用PBS/甘油）
贴壁细胞MTT实验操作：
1. 接种细胞：收集对数期实验细胞，调整细胞悬液浓度（1×104~11×105个/ml），每孔接种100ul细胞悬液（每孔细胞数量103~104个/孔）。通常只选择中间60孔用作实验，边缘孔用无菌PBS填充（当然也可以用细胞培养基，只是有点浪费）。
2. 加药处理：5%CO2，37℃孵育至细胞贴壁后即可加药，通常我们选择在前一天下午种96孔板，次日上午加药处理细胞。一般设5-7个药物梯度（用完全培养基配置2×稀释液），每孔100ul药物稀释液；每个梯度（组）设3-5个复孔，建议设5个。
3. 5%CO2，37℃细胞培养箱孵育16-48小时（按实验需要选择）。
4. 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续37℃细胞培养箱孵育4h（若药物与MTT能够反应，可先弃去孔内培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液）。
5. 终止培养，小心吸去孔内培养液（通常我们选择一次性甩去孔内培养液）。
6. 每孔加入150ul二甲基亚砜，振荡２min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪检测OD492nm/570nm各孔的吸光度值。
7. 特别说明：实验应同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）
悬浮细胞MTT实验操作与贴壁细胞基本相同，只是第5步终止培养，去孔内培养液是应先用酶标板离心机4000rpm离心5~10min（如果没有也可以想其他替代办法）。
注意事项
There are lot of commercial products for choice.
|
