(5) 倒掉去离子水覆盖液，并用吸水纸吸掉残留的液体。将凝胶板重新垂直放置，轻轻加入5%浓缩胶液（注意避免产生气泡），插入样品梳，室温凝胶约40 分钟。

(6) 轻轻拔去梳子，将玻璃夹板“凹”面贴紧电泳槽，两侧用夹子很好的固定在电泳槽上。

样品变性及电泳

(1) 由-80℃冰箱取出提取的组织总蛋白样品，立即插入冰中（减少蛋白降解）待其融化。

(2) 根据蛋白定量结果，加入相应体积的总蛋白样品与5×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液, 轻轻混合，95℃变性10分钟，立即插入冰中待用。

(3) 将样品轻轻加至凝胶孔中，电泳仪设置成稳压状态，接通电源，将电压调至80V 使样品通过浓缩胶与分离胶（电压约8v/cm）。电泳使染料至分离胶适当位置，结束电泳。

3.4 凝胶转膜及其检测

凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物上，然后分别用非标记一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育、检测。用于Western 印迹法的固相支持物有多种，本实验采用PVDF膜作为固相支持物。本实验采用湿转的转膜方式。

(1) PVDF膜的预处理：先置于100%甲醇中浸泡2-3min，水、电转液依次漂洗2min×2次，置于电转液中备用；

(2) 剪裁与胶同样大小的6 层滤纸，用转移缓冲液浸泡后待用。

(3) 取下电泳板，将其平置（使“凹”面玻璃板在下），小心取出夹板中的垫片及去掉上层玻璃板，切除多余凝胶，将含样品胶用电转液漂洗一次。

(4) 将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由阴极侧开始，依次为海绵垫片→3 层滤纸→样品胶→PVDF膜→三层滤纸（注意：排除气泡）→海绵垫片，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中。

(5) 正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动。接通电源，恒压状态下，65v转膜2h（此步操作宜在4℃冰箱中进行）。

(6) 封闭：小心取出转移膜置于封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动状态下封闭1h。

(7) 一抗反应：将一抗用封闭液稀释1000倍；将封闭后的膜直接放入一抗工作液中，4℃反应过夜。

(8) 洗膜：将反应膜放入平皿中，用1× TBST 洗涤三次，（室温下缓慢摇动洗涤）每次10 分钟，洗净未结合的一抗。

(9) 二抗反应：将二抗用1×TBST 稀释3000 倍；将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中（室温、避光缓慢摇动）作用60 分钟。

(10) 洗膜：用1×TBST 洗膜，方法同(8)，洗去游离二抗。

(11) 曝光及洗片：

①按1：1（v/v）混合ECL 试剂盒中两种液体。

②将上述混合液均匀铺在PVDF膜表面，室温作用4分钟。抖掉膜上液体，将其放入铺有保鲜膜的曝光盒中，再将保鲜膜折叠，以包裹住PVDF膜。

(12) 曝光完成后将膜用PBST洗10min，用膜再生液洗涤30min，再用PBST洗3×10min，将膜封闭后再加一抗进行下一个抗体的检测。

材料及仪器：

分析仪器：

采用美国UVP分析仪器，对胶片进行扫描，然后括住每一个条带，系统自动生成灰度值，即为结果。