动物组织/细胞线粒体DNA提取试剂盒，适用于分离完整度高的线粒体DNA，提取的动物组织或细胞线粒体DNA可用于YCR扩增， qYCR检测，测序等，搭配一科2×Fast sTaq YCR预混液（Y3315-01）+YCR仪 （YT-9600）进行YCR实验，实验结果更好。

产品信息

产品简介

线粒体DNA（mtDNA）是真核细胞生物第二套基因组DNA，是除细胞核之外唯一含有DNA的细胞器，并且具有很高的保守性，有独立于细胞核的蛋白翻译系统和遗传密码，这些特点使之成为很好的进化研究对象。

本产品提取的动物组织或细胞线粒体DNA可用于所有下游应用。

应用：

1. YCR扩增（如：人源线粒体指标有ND1、ATP8、COX1、CYTB、16S等）

2. qYCR检测

3. 测序

特点：

1. 采用碱裂解法分离完整度较高的线粒体DNA

2. 可减少核基因组DNA污染

3. 试剂包含指示剂，通过其颜色的变化，指示线粒体是否完全裂解

4. 纯化的线粒体DNA应用范围广

样本种类、样本量：

60-100 mg动物组织，1-2×10⁷培养细胞

储存与运输

线粒体分离试剂A、线粒体分离试剂B、BSA Solution、RNase A冰袋（wet ice）运输，-20℃保存；其余试剂室温运输，室温储存；有效期12个月。

组成

使用前准备

1. 提前预冷离心机至4℃。

2. 自备玻璃匀浆器，使用前冰上预冷。

3. Buffer M1在使用前先加入全部的RNase A并混匀，置于2-8℃保存。

4. 使用前请先检查Buffer M2是否出现混浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热数分钟，即可恢复澄清。

5. Buffer M2使用后应立即拧紧盖子，避免试剂长时间与空气接触。

6. 使用前向Buffer YW加入40 mL无水乙醇。

操作流程图

操作步骤

一、线粒体分离

组织或细胞匀浆：

1. 样本处理：

1) 组织匀浆：称取60-100 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织，用1 mL预冷的PBS或生理盐水冲洗2次，用剪刀剪至1-3 mm³的碎块后加入1 mL预冷的PBS或生理盐水，1,000 g，4℃离心3 min，用移液器吸除上清；

2) 培养细胞匀浆：收集1-2×10⁷个细胞，加入1 mL预冷的PBS，1,000 g，4℃离心5 min，弃上清，重复一次。

2. 加入1 mL线粒体分离试剂A（肌肉样本需加入20 µL的BSA Solution），使用移液器轻轻吹打重悬样本；

3. 将样品转移到预冷的小容量玻璃匀浆器中，冰浴上下研磨10-30次（细胞样本研磨次数为25-50次）；

4. 将匀浆液转移到1.5 mL离心管中，1,000 g，4℃离心10 min（此时的沉淀包含细胞核、细胞碎片、未破碎的细胞等）；

5. 对于组织样品，将上清转移至新的1.5 mL离心管，1,000 g，4℃再次离心10 min，细胞样本可直接进行下一步；

6. 将上清转移至新的1.5 mL离心管中，12,000 g，4℃离心10 min，弃上清，沉淀即为线粒体（如果后续需要对胞质蛋白进行分析，保存此步上清液）；

7. 向线粒体沉淀中加入500 µL线粒体分离试剂A，使用移液器轻轻吹打重悬线粒体沉淀，12,000 g，4℃离心10 min，尽可能除去上清；

8. 重复步骤7；

9. 线粒体沉淀立即进行线粒体DNA提取或-80℃保存。

培养细胞试剂法裂解：

1. 收集1-2×10⁷个细胞，加入1 mL预冷的PBS，1,000 g，4℃离心5 min，弃上清，重复一次；

2. 加入1 mL预冷的线粒体分离试剂B，使用移液器轻轻反复吹打25-50次，冰上孵育10 min；

3. 1,000 g，4℃离心10 min（此时的沉淀包含细胞核、细胞碎片、未破碎的细胞等，请勿丢弃，进行二次破膜）；

4. 将上清转移至新的1.5 mL离心管中，12,000 g，4℃离心10 min，弃上清，沉淀即为线粒体（如果后续需要对胞质蛋白进行分析，保存此步上清液）；

5. 将步骤3得到的沉淀重复步骤2-4操作进行二次破膜收集线粒体沉淀；

6. 向两管线粒体沉淀中各加入250 µL线粒体分离试剂A，使用移液器轻轻地重悬线粒体沉淀并合并为一管，12,000 g，4℃离心10 min，弃上清；

7. 加入500 µL线粒体分离试剂A，12,000 g，4℃离心10 min，弃上清；

8. 线粒体沉淀立即进行线粒体DNA提取或-80℃保存。

二、线粒体DNA提取

1. 向60-100 mg动物组织或1-2×10⁷个培养细胞分离的线粒体沉淀中加入250 μL Buffer M1，使用移液器吹打混匀，此时溶液为红色；

2. 向离心管中加入250 μL Buffer M2，温和地上下翻转6-8次使线粒体充分裂解（溶液颜色为澄清的紫色；如紫色中混杂有浑浊的红色，则说明裂解不充分，继续混匀直至溶液颜色完全变为澄清的紫色，此步最好不超过5 min）；

3. 向离心管中加入350 μL Buffer M3，立即快速地上下颠倒混匀6-8次，充分混匀，此时将出现絮状沉淀，10,000 g离心5 min（溶液为澄清的黄色，如在黄色中混有紫色，则说明复性不充分，继续混匀至溶液颜色完全变为澄清的黄色）；

4. 将上清液转移至Bind DNA Mini Column中，注意尽量不要吸取沉淀，10,000 g离心30 s，弃去Collection Tube中的废液，将Bind DNA Mini Column放入Collection Tube中；

5. 向Bind DNA Mini Column中加入700 μL Buffer YW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），10,000 g离心30 s，弃掉废液；

6. 将Bind DNA Mini Column放入Collection Tube中，10,000 g离心30 s，除去残留的液体；

7. 将Bind DNA Mini Column放入一新的1.5 mL Nuclease-free离心管中，向Bind DNA Mini Column的膜中间位置悬空滴加30-50 μL Elution Buffer或Nuclease-free Water（60-65℃预热Elution Buffer或Nuclease-free Water后再使用效果更好），10,000 g离心1 min，收集线粒体DNA溶液（注意：为了提高线粒体DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回Bind DNA Mini Column中，10,000 g离心1 min，收集线粒体DNA溶液）。

注意事项

1. 请勿使用冻存组织或细胞。

2. 分离线粒体的所有步骤需在冰上进行，所用溶液及器具需提前预冷。

3. 肌肉或心脏组织分离线粒体时可适当增加研磨次数。

4. 培养细胞试剂法分离线粒体可以进行高通量操作，线粒体得率可能低于匀浆法。

5. 如果处理大于100 mg组织或2×10⁷个细胞，需按比例增加各试剂用量。

6. 线粒体DNA含量很低，电泳检测不到。

7. 各溶液使用后请及时将盖子拧紧，防止溶剂挥发。

8. 操作时请穿实验服，并佩戴一次性手套。

产品仅供科研用途，不用于临床诊断！

实验案例

使用Y3762 动物组织/细胞线粒体DNA提取试剂盒的试剂裂解法提取1×10⁷ 293FT细胞线粒体DNA，进行qYCR扩增13个线粒体编码基因以及2个线粒体rRNA基因，结果显示（图1）：15个线粒体特异都能有效扩增，线粒体DNA提取效果较好。

2. 使用Y3762 动物组织/细胞线粒体DNA提取试剂盒提取100 mg小鼠肌肉组织线粒体DNA，进行qYCR扩增13个线粒体编码基因以及2个线粒体rRNA基因，结果显示（图2）：15个线粒体特异基因都能有效扩增，线粒体DNA提取效果较好。

（产品包装升级中，以实物为准。）