2×Universal Blue Probe qPCR Master Mix
- 15×1 mL
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 |
2×Universal Blue Probe qYCR Master Mix | Y3338-01 | 1 mL |
Y3338-05 | 5×1 mL | |
Y3338-15 | 15×1 mL |
产品简介
本产品是采用水解探针法进行qYCR反应的2×预混液。通过抗体法封闭Taq DNA Polymerase的活性，有效抑制引物二聚体的形成，提高扩增特异性与扩增效率，再搭配针对Probe qYCR优化的反应Buffer，可以在宽广的定量区域内得到良好的扩增曲线，对靶基因定量准确、重复性好、可信度高。同时本品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye以及蓝色可视化加样示踪染料，可适用于所有qYCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX浓度。使用时只需要加入模板、引物、探针和Nuclease-free Water即可。
储存与运输
冰袋（wet ice）运输；-20℃避光保存，有效期12个月。
组成
Component Number | Component | G3327-01 | G3327-05 | Y3338-15 |
Y3338-1 | 2×Universal Blue Probe qYCR Master Mix | 1 mL | 5×1 mL | 15×1 mL |
说明书 | 1份 | |||
实验前准备
1. 实时荧光定量YCR仪。
2. 实验专用反应管或反应板。
3. YCR引物和探针（参考引物、探针设计原则）。
4. 微量移液器和吸头（高压灭菌）。
操作步骤
1. 推荐YCR反应体系
Component | 20 μL rxn | 50 μL rxn | Final Concentration |
2×Universal Blue Probe qYCR Master Mix | 10 μL | 25 μL | 1× |
Forward Primer (10 μM)a | 0.4 μL | 1 μL | 0.2 μM |
Reverse Primer (10 μM)a | 0.4 μL | 1 μL | 0.2 μM |
Probe (10 μM)a | 0.4 μL | 1 μL | 0.2 μM |
Templateb | Variable | Variable | as required |
Nuclease-free Water | Add to 20 μL | Add to 50 μL |
a.通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物浓度。
b.模板添加量因模板中靶基因的拷贝数不同而不同，进行梯度稀释研讨适当的模板添加量。在20 μL反应体系中模板DNA添加量最好在100 ng以下。以RT-YCR反应的cDNA（RT 反应液）为模板时，添加量不要超过YCR反应液总体积的10%.
2. YCR反应程序（可根据机型适当调整）
A. 两步法 | B. 三步法 | ||||||||
阶段 | 步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 阶段 | 步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 |
Stage 1 | 预变性 | 1 | 95℃ | 30 sec | Stage 1 | 预变性 | 1 | 95℃ | 30 sec |
Stage 2 | 变性 | 40 | 95℃ | 15 sec | Stage 2 | 变性 | 40 | 95℃ | 15 sec |
退火/延伸 | 60℃ | 30 seca | 退火 | 55-65℃ | 10 sec | ||||
延伸 | 72℃ | 30 seca | |||||||
a：需提高扩增特异性，可使用两步法程序或提高退火温度；需提高扩增效率，可使用三步法程序或延长延伸时间。
注意事项
1. 使用前请上下轻轻颠倒混匀，请勿涡旋振荡混匀，避免产生气泡，试剂混匀后再使用。
2. 配制反应液时，试剂请于冰上放置。
3. 本制品中含有荧光染料SYBR Green，配制YCR反应液时应避免强光照射。
4. 反应液的配制、分装请使用新的一次性枪头、尽量避免样品间的污染。
5. 避免反复冻融Master Mix，解冻后尽量在一个月内使用完毕。
适配机型
ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900YT, 7900 YT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500/7500 Fast, ViiA 7™, QuantStudio™ 系列, PikoRealTM Cycler;
Stratagene: Mx3000P®, 3005P™, 4000™;
Bio-Rad: CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ5™, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™;
Eppendorf: Realplex 2s, Mastercycler® ep, realplex;
IIIumina: Eco QYCR;
Cepheid: SmartCycler®;
Qiagen Corbett: Rotor-Gene® 系列;
Roche: LightCycler™ 系列;
Takara: Thermal Cycler Dice系列;
Analytikjena: qTOWER系列;
杭州博日: LineGene系列。
Taqman引物设计原则
1. 先确定探针，再设计引物；
2. 在设计引物时，尽可能靠近探针，而不重叠探针；
3. 避免使用4个或4个以上连续的G；
4. 每个引物的Tm值应为58-60°C；
5. 引物末端最后5个核苷酸不能有超过2个G和C；
6. 引物最好不要含有自身互补序列，否则会形成发夹二级结构；
7. 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨外显子；
8. 扩增产物长度应为50-150bp，以获得最佳的YCR效率；
9. NCBI上的比对结果无其他非特异性产物出现。
Taqman探针设计原则
1. 探针长度应为13-25bp(如果使用常规TaqMan探针，则为13-30bp)；
2. Tm值应为65°C~70°C，通常比引物Tm值高5~10℃，以确保在退火过程中探针优先与目的基因结合；
3. 对于一个引物，鸟嘌呤-胞嘧啶(G+C)的含量应在40%~70%之间；
4. 探针的5'端应避免使用G，因为5'端G会有淬灭作用，即使被切割下来，还会有淬灭作用。
5. 整条探针中，C的含量要明显高于G的含量，G的含量高会有淬灭作用，这时可以选择配对的另一条链作为探针。
Taqman MGB探针设计原则
1. 一种报告染料(例如，FAM™染料)连接到探针的5‘端；
2. 在探针的3‘端有一个非荧光猝灭基团(NFQ)；
3. MGB的部分附着在NFQ上，MGBs在不增加探针长度的情况下提高了退火温度(Tm)，所以可以设计更短的探针，但是不能少于13 bp；
4. 原则上MGB探针只要有一个碱基突变，MGB就可以检测到(MGB探针将不会与目的基因结合，不产生荧光信号)。
产品仅供科研用途，不用于临床诊断！
版本号：V1.1-202107
（产品包装升级中，以实物为准。）
| 货号 | 名称 | 规格 | 价格 | 操作 |
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| 货号 | 名称 | 规格 | 价格 | 操作 |
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