产品信息

产品简介
 

本产品是采用水解探针法进行qYCR反应的2×预混液。通过抗体法封闭Taq DNA Polymerase的活性，有效抑制引物二聚体的形成，提高扩增特异性与扩增效率，再搭配针对Probe qYCR优化的反应Buffer，可以在宽广的定量区域内得到良好的扩增曲线，对靶基因定量准确、重复性好、可信度高。同时本品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye以及蓝色可视化加样示踪染料，可适用于所有qYCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX浓度。使用时只需要加入模板、引物、探针和Nuclease-free Water即可。

储存与运输
 

冰袋（wet ice）运输；-20℃避光保存，有效期12个月。

组成
 

实验前准备

1. 实时荧光定量YCR仪。

2. 实验专用反应管或反应板。

3. YCR引物和探针（参考引物、探针设计原则）。

4. 微量移液器和吸头（高压灭菌）。

操作步骤
 

1. 推荐YCR反应体系

a.通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物浓度。

b.模板添加量因模板中靶基因的拷贝数不同而不同，进行梯度稀释研讨适当的模板添加量。在20 μL反应体系中模板DNA添加量最好在100 ng以下。以RT-YCR反应的cDNA（RT 反应液）为模板时，添加量不要超过YCR反应液总体积的10%.

2. YCR反应程序（可根据机型适当调整）

a：需提高扩增特异性，可使用两步法程序或提高退火温度；需提高扩增效率，可使用三步法程序或延长延伸时间。

注意事项

1. 使用前请上下轻轻颠倒混匀，请勿涡旋振荡混匀，避免产生气泡，试剂混匀后再使用。

2. 配制反应液时，试剂请于冰上放置。

3. 本制品中含有荧光染料SYBR Green，配制YCR反应液时应避免强光照射。

4. 反应液的配制、分装请使用新的一次性枪头、尽量避免样品间的污染。

5. 避免反复冻融Master Mix，解冻后尽量在一个月内使用完毕。

适配机型
 

ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900YT, 7900 YT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500/7500 Fast, ViiA 7™, QuantStudio™ 系列, PikoRealTM Cycler;

Stratagene: Mx3000P®, 3005P™, 4000™;

Bio-Rad: CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ5™, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™;

Eppendorf: Realplex 2s, Mastercycler® ep, realplex;

IIIumina: Eco QYCR;

Cepheid: SmartCycler®;

Qiagen Corbett: Rotor-Gene® 系列;

Roche: LightCycler™ 系列;

Takara: Thermal Cycler Dice系列;

Analytikjena: qTOWER系列;

杭州博日: LineGene系列。

Taqman引物设计原则
 

1. 先确定探针，再设计引物；

2. 在设计引物时，尽可能靠近探针，而不重叠探针；

3. 避免使用4个或4个以上连续的G；

4. 每个引物的Tm值应为58-60°C；

5. 引物末端最后5个核苷酸不能有超过2个G和C；

6. 引物最好不要含有自身互补序列，否则会形成发夹二级结构；

7. 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨外显子；

8. 扩增产物长度应为50-150bp，以获得最佳的YCR效率；

9. NCBI上的比对结果无其他非特异性产物出现。

Taqman探针设计原则
 

1. 探针长度应为13-25bp(如果使用常规TaqMan探针，则为13-30bp)；

2. Tm值应为65°C~70°C，通常比引物Tm值高5~10℃，以确保在退火过程中探针优先与目的基因结合；

3. 对于一个引物，鸟嘌呤-胞嘧啶(G+C)的含量应在40%~70%之间；

4. 探针的5'端应避免使用G，因为5'端G会有淬灭作用，即使被切割下来，还会有淬灭作用。

5. 整条探针中，C的含量要明显高于G的含量，G的含量高会有淬灭作用，这时可以选择配对的另一条链作为探针。

Taqman MGB探针设计原则
 

1. 一种报告染料(例如，FAM™染料)连接到探针的5‘端；

2. 在探针的3‘端有一个非荧光猝灭基团(NFQ)；

3. MGB的部分附着在NFQ上，MGBs在不增加探针长度的情况下提高了退火温度(Tm)，所以可以设计更短的探针，但是不能少于13 bp；

4. 原则上MGB探针只要有一个碱基突变，MGB就可以检测到(MGB探针将不会与目的基因结合，不产生荧光信号)。

产品仅供科研用途，不用于临床诊断！

版本号：V1.1-202107

（产品包装升级中，以实物为准。）