产品信息

产品简介

本试剂盒采用了传统的碱裂解法，从细菌中提取各种转染级别的质粒DNA，本试剂盒吸附柱中的的硅胶膜经过特殊处理，极大的提高了质粒DNA的吸附作用，可从5-15 mL过夜培养的大肠杆菌中分离20-100 µg的质粒DNA，再搭配Buffer ER和Buffer ED有效的去除质粒DNA中的内毒素（内毒素含量≤0.1 EU/μg）、蛋白等杂质，提取的高纯度质粒DNA可直接用于转染、酶切、转化、YCR、测序等各种分子生物学实验。

储存与运输

RNase A冰袋（wet ice）运输，-20℃保存；其余试剂室温运输及储存；有效期12个月。

组成

使用前须知（请仔细阅读）

1. 准备冰浴和42℃水浴或加热模块。

2. 使用前请先检查各缓冲液是否出现浑浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热数分钟，即可恢复澄清。

3. 使用前先将RNase A全部加入Buffer P1中，并于2-8℃可保存6个月。

4. Buffer P2使用后应立即盖紧盖子，避免试剂长时间与空气接触。

5. Buffer P3使用前请于4℃预冷。

6. Buffer YW使用前加入80 mL的无水乙醇。

操作步骤

1. 柱平衡步骤：向HiBind DNA Mini Column中加入500 μL Buffer BL，12,000 rpm（~13400×g）室温离心1 min，弃掉废液，将HiBind DNA Mini Column重新放回Collection Tube中（处理过的柱子最好立即使用）；

2. 取5-15 mL过夜培养菌液，12,000 rpm（~13400×g）室温离心1 min收集菌体于2 mL离心管中（尽量将上清全部去除）；

3. 加入500 μL Buffer P1（使用前确认是否加入RNase A），使用移液器吹打或涡旋振荡彻底悬浮菌体（务必使菌体彻底分散，否则会影响裂解，导致提取质粒的质量和纯度偏低）；

4. 加入500 μL Buffer P2立即温和地上下颠倒1 min充分裂解菌体（此步不可剧烈震荡，避免造成基因组DNA剪切断裂，并且应保证在5 min以内完成。如果菌液未变澄清可继续颠倒混匀数次，并且不超过5 min。如果一直未变得清亮可能是菌体过多，应考虑降低菌体量），此时溶液应变得清亮粘稠；

5. 加入500 μL Buffer P3（提前4℃预冷）立即温和的上下颠倒10-12次充分混匀，溶液出现紧实白色絮状沉淀，室温放置10 min，12,000 rpm（~13400×g）离心15 min，形成致密白色沉淀，取上清于新的2 mL离心管中；

6. 加入150 μL Buffer ER，颠倒混匀后冰上放置10 min（期间颠倒混匀3-5次），溶液呈透明蓝色；

7. 42℃孵育5 min，溶液恢复浑浊，12,000 rpm室温离心10 min（离心机温度必须恢复至室温，否则会影响分层），溶液分为上下两层（如果分层不明显，室温放置1-3 min），上层为澄清水相，下层为蓝色，小心收集上层水相至新的1.5 mL离心管中;

8. 加入0.5倍上述溶液体积的无水乙醇，上下颠倒混匀后转移到HiBind DNA Mini Column中（每次加入液体量不超过700 μL）；

9. 室温12,000 rpm（~13400×g）室温离心1 min，弃掉Collection Tube中的废液，将HiBind DNA Mini Column重新放回Collection Tube中（第8步的溶液可进行多次过柱）；

10. 向吸附柱中加入600 μL Buffer ED 12,000 rpm（~13400×g）室温离心1 min，弃掉Collection Tube中的废液，将HiBind DNA Mini Column重新放回Collection Tube中；

11. 向HiBind DNA Mini Column中加入700 μL Buffer YW 12,000 rpm（~13400×g）室温离心1 min，弃掉Collection Tube中的废液，将HiBind DNA Mini Column重新放回Collection Tube中；

12. 重复操作步骤11；

13. 12,000 rpm（~13400×g）室温离心2 min；

14. 将HiBind DNA Mini Column置于新的1.5 mL Collection Tube中，将HiBind DNA Mini Column开盖室温放置10 min，使乙醇彻底挥发，

15. 向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300 μL Buffer TE或Endo-free Water，室温放置5 min，12,000 rpm（~13400×g）离心2 min。如果需要增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到HiBind DNA Mini Column中，室温放置5 min后，12,000 rpm（~13400×g）离心2 min；

16. 得到的质粒DNA可于-20℃长期保存。

注意事项

1. 操作之前，请务必认真阅读本产品说明书。

2. 避免直接接触Buffer P2、Buffer P3，Buffer ED使用后应立即盖紧盖子。

3. 提取的质粒DNA大于10 kb时，应增加菌体收集量。

4. 可将洗脱液于60-65℃预热，并延长洗脱孵育时间，可提高洗脱效率。

5. 洗脱质粒前应使乙醇完全挥发，避免残留的乙醇影响下游实验。

6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

本产品仅供科研用途，不用于临床诊断！

附操作流程简图

（产品包装升级中，以实物为准。）