产品信息

产品简介

免疫沉淀或免疫共沉淀是研究蛋白或蛋白之间相互作用（Protein-Protein Interactions，PPIs）的常用技术，通过使用特异性抗体和可结合抗体的介质（如Protein A/G Agarose或Protein A/G Magrose）或直接使用偶联特异性抗体的介质（如琼脂糖凝胶或磁珠），通过离心或磁力从溶液中分离出抗原和抗体复合物，从而达到分离和纯化目标蛋白的目的，随后可用于蛋白免疫印迹（Western Blot）或质谱分析；Protein A/G是一种发现于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁表面蛋白，分子量为42 kDa；Protein G是C型或G型链球菌(Streptococcal bacteria)表达的免疫球蛋白结合蛋白；Protein A和Protein G功能相似，能特异性地与哺乳动物免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)结合；经重组改造的Protein A、G与琼脂糖凝胶以一定的方式结合，可用于免疫沉淀；Protein A/G琼脂糖凝胶适合于免疫沉淀human IgG1、IgG2、IgG4，mouse IgG2a、IgG2b等，而Protein G琼脂糖凝胶适合于免疫沉淀human IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，mouse IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，rat IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c等多克隆抗体（具体信息见附表一）。

本产品采用自主研发生产的Protein A/G蛋白标记琼脂糖凝胶，与市场上同类产品相比，该产品结合抗体效率更高，非特异性结合率更低，配合优化后的缓冲液，可便捷高效的进行免疫沉淀实验；可广泛应用于细胞裂解物、细胞分泌上清、血清、腹水等样品中目标蛋白的分离与纯化；本试剂盒提供两种洗脱方法（变性洗脱和酸洗脱）对目的蛋白进行洗脱。

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储存与运输

冰袋（wet ice）运输；5×蛋白上样缓冲液（还原型）请保存于-20℃，其他2-8℃保存，有效期12个月。

试剂盒组成

需自备的试剂

操作步骤

1. 试剂盒的准备：

a) 参照下表，按照每个样品使用100-500 μL裂解液的比例，准备相关试剂；

b) 含蛋白酶抑制剂的IP裂解液的配制：参照上表，按照每50-100万细胞使用100-200 μL含蛋白酶抑制剂Cocktail的裂解液用于裂解；将IP裂解液与50×Cocktail蛋白酶抑制剂（推荐Y2017-250UL）按照50:1的比例混合，例如在1 mL IP裂解液中加入20 μL 50×Cocktail蛋白酶抑制剂，即得1 mL含蛋白酶抑制剂的IP裂解液；配制好的含抑制剂的IP裂解液宜放置在冰浴或4℃；

c) 注意：如果免疫沉淀的目标蛋白涉及磷酸化或乙酰化修饰，需要添加磷酸酶抑制剂或去乙酰化酶抑制剂（自备）；含抑制剂的IP裂解液宜现配现用，不宜配制后冻存并留作后续使用；

d) 1×TBS的配制：将10×TBS缓冲液用超纯水稀释至1×，即为1×TBS；例如1 mL 10×TBS缓冲液加入9 mL超纯水，混匀后即为1×TBS缓冲液；

e) 1×蛋白上样缓冲液（还原型）的配制：取适量5×蛋白上样缓冲液（还原型）用超纯水稀释5倍即为1×蛋白上样缓冲液（还原型）；例如0.2 mL 5×蛋白上样缓冲液（还原型）加入0.8 mL超纯水，混匀后即为1×蛋白上样缓冲液（还原型）。

2. 抗原样本制备:

样品裂解后应立即进行后续免疫沉淀或免疫共沉淀实验，如果不能立即进行，可以将样品保存于-20℃或-80℃冰箱，但冻融可能会影响蛋白与蛋白的相互作用；所有的样品裂解步骤应冰浴或4℃操作，以尽量降低蛋白降解的可能性，样品准备好之后取一定量作为Input或Total，以用于后续Western Blot等检测；

对于组织样品：

a) 取适量组织用预冷PBS（推荐Y4213）洗涤，去除血污，剪成细小碎块置于匀浆器中；

b) 按照每10-20 mg组织使用100-200 μL的比例加入含蛋白酶抑制剂的IP裂解液，如果需要更高浓度的蛋白样品，可以适量减少IP裂解液的用量；

c) 用玻璃匀浆器或手持式匀浆机进行匀浆，或者使用本公司自主研发的YWE-FP低温型研磨仪进行充分研磨； 

d) 将匀浆液转移至1.5 mL离心管中，振荡混匀，冰浴30 min，期间每10 min用移液器反复吹打，确保组织细胞完全裂解；

e) 12000 g 4℃离心5 min，收集上清，即为总蛋白溶液，可进行后续免疫沉淀或免疫共沉淀实验等；

对于贴壁细胞样品：

a) 如有必要，可用PBS清洗细胞2-3次，最后一次彻底吸干残留液；

b) 用细胞刮刀将细胞刮下或胰蛋白酶消化细胞使其充分悬浮，收集到1.5 mL离心管中1000 g 4℃离心5 min，弃上清即为细胞沉淀；

c) 按照每50-100万细胞（相当于6孔板的一个孔）加入100-200 μL含蛋白酶抑制剂的IP裂解液；轻弹管底或适当吹打，冰浴3-5 min，以充分裂解细胞，充分裂解后应没有明显的细胞沉淀；如果细胞量较多，建议分装成50-100万细胞/管，然后再裂解，以达到充分裂解的目的；

d) 充分裂解后，12000 g 4℃离心5 min，收集上清，即为总蛋白溶液，可进行后续免疫沉淀或免疫共沉淀实验等；

对于悬浮细胞样品：

a) 1000 g 4℃离心5 min收集细胞沉淀；如有必要，可以用PBS洗涤一次，然后吸净残留的液体，轻轻涡旋或弹击管底以使细胞尽量分散开；

b) 按照每50-100万细胞加入100-200 μL的比例加入含蛋白酶抑制剂的IP裂解液，轻轻吹打以充分分散细胞；如果细胞量较多，建议分装成50-100万细胞/管，然后再裂解，以达到充分裂解的目的；

c) 冰浴5 min，12000 g 4℃离心5 min，取上清，即为总蛋白溶液，可进行后续免疫沉淀或免疫共沉淀实验等；

对于细菌或酵母样本：

a) 取1 mL菌液或酵母液，离心去上清，如有必有，可以使用PBS洗涤一次，然后吸净残留的液体，轻轻涡旋或者弹击管底以使细菌或酵母尽量分散开；

b) 加入100-200 μL含蛋白酶抑制剂的IP裂解液，轻轻吹打以充分分散细菌或真菌

c) 冰浴10 min，如果希望获得更好的裂解效果，细菌和酵母可以分别使用溶菌酶和破壁酶（自备）消化，然后再使用含蛋白酶抑制剂的IP裂解液进行裂解；

d) 12000 g 4℃离心5 min，取上清，即为总蛋白溶液，可进行后续免疫沉淀或免疫共沉淀实验等；

3. 琼脂糖凝胶准备：

a) 轻轻重悬SweAgarose Protein A/G凝胶，尽量形成均匀的凝胶悬浊液，按照通常每500 μL样本中加入20 μL混合均匀的凝胶悬浊液，取适量凝胶悬浊液于一洁净YP管中，加入1×TBS至终体积为0.5 mL (以下免疫沉淀步骤中都以每个样品加入20 μL凝胶悬浊液为例)； 

b) 轻轻重悬凝胶，6000×g在4℃离心30 s，小心去除上清，不要吸到凝胶，重复上述步骤两次；

c) 按照初始的凝胶悬浊液的体积，用1×TBS重悬凝胶；

4. 抗体与SweAgarose Protein A/G琼脂糖凝胶的结合

a) 抗体的准备：按照抗体使用说明中推荐的稀释比例用1×TBS稀释抗体，配制成抗体工作液；或将抗体配制成终浓度5-50 μg/mL的抗体工作液，置于冰上备用；（可选做：使用抗体种属相同的正常IgG配制相同稀释比或终浓度5-50 μg/mL的正常IgG工作液，去除非特异性结合或作为阴性对照；所谓种属相同的正常IgG是指如果后续免疫沉淀时用的抗体是小鼠IgG，则在本步骤中可以用1×TBS稀释适量的正常小鼠IgG以用于降低背景或作为阴性对照）；

b) 抗体吸附：将步骤3中准备好的SweAgarose Protein A/G琼脂糖凝胶进行离心分离，6000×g在4℃离心30 s，吸除上清，加入500 μL抗体工作液或正常IgG工作液，重悬后在室温翻转混匀仪上孵育38-60 min； 

注：也可以直接在步骤3准备好的SweAgarose Protein A/G琼脂糖凝胶中加入适量抗体或正常IgG进行孵育；

c) 凝胶分离及洗涤：孵育完成的凝胶进行离心分离，6000×g在4℃离心30s，吸除上清，加入500 μL的1×TBS，用移液器轻轻吹打重悬SweAgarose Protein A/G琼脂糖凝胶，6000×g在4℃离心30 s，去除上清，重复洗涤三次，按照初始体积的量，用1×TBS重悬凝胶；

注：孵育和洗涤过程中，如果凝胶发生团聚或呈片状属正常现象，不会影响实验结果；

5. 免疫沉淀（IP）：

a) 去除非特异性结合（可选做）：步骤4中准备的结合了正常IgG的SweAgarose Protein A/G琼脂糖凝胶与样品4℃孵育60 min后6000×g在4℃离心30 s，上清样品用于后续实验；本实验步骤的目的是去除与正常IgG产生非特异性结合的蛋白；

b) 样品与结合了抗体或正常IgG的SweAgarose Protein A/G琼脂糖凝胶孵育：按照每500 μL蛋白样品加入20 μL凝胶悬浊液的比例加入结合了抗体或正常IgG的SweAgarose Protein A/G琼脂糖凝胶，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育2小时或4ºC孵育过夜；

注1：孵育过程中，如果凝胶发生团聚或呈片状属正常现象，不会影响实验结果；

注2：也可先将适量抗体或正常IgG与样品室温孵育1-2小时或4℃孵育过夜后，再加入10-20 μL凝胶悬浮液室温孵育60 min。

c) 离心分离：孵育完毕后，6000×g在4℃离心30 s，去除上清；

注：可保留部分上清液，用于检测免疫沉淀的效果；

d) 洗涤：加入500 μL的1×TBS，用移液器轻轻吹打重悬凝胶，6000×g在4℃离心30 s，去除上清，重复洗涤三次；

注：也可以通过检测洗涤得到的洗涤液的OD280来判断是否洗涤完全，若OD280大于0.05，应适当增加洗涤次数；

6. 洗脱：

根据目的蛋白的特点及后续实验要求，可以选择如下方法之一进行洗脱；

a) 变性洗脱法：此法洗脱的样品适用于 SDS-PAGE检测，离心去上清后，向其中加入25 µL 1×蛋白上样缓冲液（还原型）混合均匀，95℃加热5 min，然后执行离心分离收集上清液即可进行Western blot检测；

b) 酸性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析，离心去上清后，向其中加入20 µL Acid Elution Buffer混合均匀，室温孵育10 min，然后执行离心分离，收集上清液至新的YP管，并立即加入2 µL Neulization Elution Buffer将洗脱产物pH调节至中性，用于后期功能分析；

注：用户可根据实际想获得体积调整洗脱缓冲液的加入量。

注意事项

1. 试剂盒中组分SweAgarose Protein A/G请勿保存于-20℃或反复冻融，否则会影响凝胶的性能，造成不必要的实验误差。

2. 在进行免疫沉淀操作之前，请务必认真阅读本操作说明书。

3. 如果免疫沉淀的目的蛋白涉及磷酸化修饰或者乙酰化修饰，需要自备相应的磷酸酶抑制剂和去乙酰化酶抑制剂。

4. 凝胶需维持pH为6-8，避免高速离心、干燥或冻存，否则可能会引起凝胶聚团。

5. 凝胶使用前要充分混匀，混匀操作须轻柔，不宜剧烈涡旋震荡等，避免抗体变性等。

6. 在免疫沉淀时，建议设置阳性和阴性对照组（SweAgarose Mouse IgG）。

7. 蛋白样品收集后应尽快完成纯化工作，并始终放置在4℃或冰浴，以减缓蛋白降解或变性。

8. 酸性溶液洗脱时凝胶可能会发生聚集，属于正常现象，不影响凝胶的正常使用。

9. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

10. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

11. Protein A、Protein G对不同种属来源及亚型抗体结合能力见附表一。

附表一

产品仅供科研用途，不用于临床诊断！

（产品包装升级中，以实物为准。）