产品信息

产品简介

本试剂盒中包含Ni-NTA SweAgrose 6 Fast Flow填料、亲和柱空柱以及蛋白纯化所需的试剂。亲和填料Ni-NTA SweAgrose 6 Fast Flow对 6×His-tag 蛋白具有显著特异吸附能力，能够高效纯化超声破碎或压力破碎后细胞上清中的可溶性His标签融合蛋白。Ni-NTA填料具有 4 个 Ni²⁺螯合位点，与Ni-IDA相比，Ni-NTA结合 Ni²⁺ 更为牢固，有效地防止纯化过程中 Ni²⁺脱落并增强了对 His 标签蛋白的结合能力，提高纯化效率，对来源于各种表达系统（如杆状病毒，哺乳细胞，酵母以及细菌）中的 His 标签蛋白均有很好的纯化效果。本产品已螯合镍离子，可直接用于可溶性His标签融合蛋白的纯化，使用方便，快捷。

填料信息

储存与运输

1. 包装：PP材质试剂瓶密封包装。

2. 贮存：2-8℃，20%乙醇；填料避免冷冻。

3. 保质期：填料2-8℃存放24个月，纯化试剂2-8℃存放12个月。

试剂盒组分

产品使用方法：

1. 缓冲液准备

可溶性蛋白纯化试剂盒缓冲液配方如下：

His-tag Binding Buffer A: 25 mM Tris  500 mM NaCl  pH 8.0

His-tag Elution Buffer B: 25 mM Tris  500 mM NaCl  500 mM Imidazole   pH 8.0

可溶性蛋白重力柱纯化缓冲液推荐：

注意：推荐条件适用于大多数蛋白重力柱结合洗脱模式，可自行稀释调整咪唑浓度(Buffer A/B液按比例混合)进行分步洗杂和洗脱获得更好的蛋白纯化效果。

混合比例计算公式：B液所需体积=（所需咪唑浓度*所需咪唑浓度的体积）/500 ；取A液补足所需体积。

本试剂盒试剂可直接用于纯化仪线性梯度洗脱。（下文中提及的Binding/Wash/Elution Buffer均指推荐的含咪唑溶液的平衡/洗杂/洗脱液）。

2. 层析重力柱组装及平衡处理：

重力柱组装：详细方法可参考本公司亲和层析柱空柱（货号Y6075-12）装柱流程；

筛板处理：用纯水或者填料保存液预先对筛板进行脱气处理，将下筛板推至空柱底部后加入适量保存液浸润底部，封住下出液口；

装填：将 Ni-NTA SweAgrose 6 FF 填料上下颠倒充分混匀后取适量加入层析柱(避免剧烈摇晃)，室温静置 10 min。待凝胶与溶液分层后，打开底部出液口让乙醇通过重力作用缓慢流出，同时将上筛板垂直推至填料表面，添加保存液至满柱，装柱完成；

平衡：向装填好的柱子中加入 5 个柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净，再用 10 个柱体积的 Binding Buffer 平衡柱子。平衡结束后即可上样。

注意：柱体积指填料体积；建议装填高度不超过空柱1/3；填料保护液占比约为总体积1/3，请根据填料载量及蛋白表达量选取合适地体积的乙醇和填料混合液。

3. 样品制备：

3.1 细菌胞内表达

菌体处理：离心收集菌体，加入10倍（w:v=1:10)Binding Buffer 后充分重悬，放置于冰上。重悬后菌液可进行超声破碎或压力破碎处理。

离心过滤：4℃，15,000 g离心10-20 min。收集上清，0.45 μm滤膜过滤后备用。

注意：根据蛋白表达量高低可调整重悬比例至1：5-1：25之间；

按实验需求，破菌前可自行在缓冲液中添加蛋白酶抑制剂、溶菌酶 、核酸去除剂、蛋白稳定试剂等。本试剂盒不提供相关试剂，可单独从本公司购买PMSF（#Y2019）、Triton X-100（#YC204014）、重组溶菌酶（#G3407）、重组DNase I（#Y3353）等相关产品。如使用其它公司产品，请按照相应说明书操作。

超声破碎及压力破碎条件请参考仪器相关操作说明，尽量保持破碎过程中样品低温。

3.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白

离心处理：离心收集得到上清，如上清中不含 EDTA、组氨酸和还原剂等物质，即可过滤后直接上样，如含有 EDTA、组氨酸和还原剂等物质，需将上清可溶蛋白置换到Binding Buffer后上样。

4. 纯化流程：

上样：将处理好的样品直接加入平衡好的柱子中。以加入的体积控制流速快慢，收集流穿用于 SDS-PAGE 分析蛋白质的结合情况；

淋洗：使用5-10个柱体积的Binding Buffer冲洗上样后的柱子，洗去部分杂蛋白；

洗杂：使用15-20个柱体积的Wash Buffer冲洗柱子，分管收集洗杂液用于 SDS-PAGE 分析蛋白质的洗杂程度。也可用考马斯亮蓝G250（#Y2050）快速检测洗杂终点；

洗脱：使用约5个柱体积的Elution Buffer冲洗柱子，分管收集洗脱液便于获得较好的纯度和浓度的洗脱样。 SDS-PAGE 分析蛋白质洗脱情况；

柱保存：洗脱完成后，依次使用10个柱体积的去离子水洗涤柱子，5个柱体积的20%乙醇平衡柱子（乙醇浸没填料）。封柱后2-8℃保存。

注意：洗杂洗脱条件未达到预期纯化效果时，建议分段梯度洗脱以达到理想效果。

5. 脱镍处理：

当需要更换金属离子或者长期储存时，建议去掉镍离子。下次使用前重新装载离子激活介质。

5.1 脱镍流程：

1. 用脱镍缓冲液（500 mM NaCl，50-100 mM EDTA，pH 7.4）冲洗3~5 个柱体积；

2. 去离子水冲洗 5-10 个柱体积；

3. 用5个柱体积的20%乙醇冲洗柱子后储存。

5.2 重新挂镍：

1. 去离子水冲洗 5-10 个柱体积去掉20%乙醇保存液；

2. 加入3个柱体积的100 mM的NiSO₄重新上镍；

3. 用含100 mM NaCl平衡缓冲液或水去除过量的镍后备用。

注意：当填料多次使用出现柱料颜色变浅、有明显污染或出液速度慢等问题导致结合效率降低的情况时建议进行在位清洗。当纯化过程发生蛋白沉淀等问题时需要进行在位清洗。

6. 在位清洗（CIP）：

介质经过长期使用后，过多的污染物会使柱床反压增大，从而降低柱效与介质吸附载量，甚至损害介质的寿命。定期 CIP 可有效保护介质。如果介质轻微污染，可每 1-5 次循环进行一次 CIP。但对于实验后污染严重的介质，必须立即进行 CIP处理。在脱镍的情况下可按下述方法对介质进行 CIP： 

1. 用 1.5 M NaCl 清洗数个柱体积以去除离子结合的蛋白质，随后用去离子水冲洗约 10 个柱体积。

2. 用 1 M NaOH 清洗层析柱以去除沉淀蛋白、疏水结合蛋白和脂蛋白。接触时间通常为 1-2 小时（内毒素去除时间为 12 小时或更长），随后用去离子水冲洗约10 个柱体积。

3. 用70%乙醇或30%异丙醇清洗层析柱 5-10 个柱体积，随后用去离子水冲洗约 10 个柱体积。

注意事项：

1. 试剂盒中包含 10 mL Ni-NTA SweAgrose 6FF 填料，总体积 15 mL（保护液为20%乙醇溶液）使用前需要充分混合均匀。

2. 可在纯化之前采用SDS-PAGE检测蛋白的可溶性。本试剂盒只适合于可溶性蛋白的纯化，如需纯化包涵体蛋白，请选择包涵体蛋白纯化试剂盒。

3. 缓冲液中不建议添加 β-巯基乙醇、DTT、EDTA 。

4. 整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。

5. 为避免柱子被堵塞，建议将裂解液进行离心后，使用0.22 µm或者0.45 µm过滤器过滤去除杂质。

6. 若使用本说明书提供的纯化条件无法达到理想的纯化效果，可尝试改变洗杂液和洗脱液中咪唑的浓度或pH，以达到最优效果。

7. 柱料再生时，保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。

问题及解决方案