外泌体分离层析柱

外泌体是由细胞主动分泌到胞外的大小均一、粒径在30-150 nm的一种纳米级膜性囊泡。该囊泡具有自身特异性标志物，内部包裹了蛋白质、mRNA、miRNA、脂质等物质，可通过细胞之间物质和信号通讯，参与细胞生长、增殖、分化、迁移，以及血管新生和肿瘤生长等过程。

本产品是一种尺寸排阻色谱柱（SEC），适用于细胞上清外泌体的快速分离和纯化。本产品使用细胞上清浓缩剂分离富集细胞上清外泌体，再使用外泌体分离层析柱纯化浓缩液外泌体，既可以保留高纯度和高活性的外泌体，又可以高效去除蛋白质；有效地避免了超高速离心方法中超高离心力造成的外泌体膜结构损伤，同时减少了传统沉淀法中高浓度蛋白等对外泌体纯度的影响。

一、外泌体分离层析柱（血清/血浆）

操作步骤

1 准备工作：

1.1 自备常温、无菌的缓冲液，如PBS（推荐Y4213）；

1.2 自备常温、无菌的0.1 M NaOH、20% 乙醇；

1.3 使用分离柱前，取下分离柱红色上盖，将分离柱置于支架（推荐Y6074）待用；

2 外泌体分离：

2.1 将血清/血浆类生物样本使用0.22 μm的滤膜过滤，初步纯化备用；

2.2 取下分离柱白色底盖，待柱内保护液流出后，分批加入共30 mL的缓冲液清洗分离柱；

2.3 待筛板上方缓冲液全部进入分离柱后；取0.5 mL步骤2.1中备用血清/血浆加在筛板中央，（不足0.5 mL加入缓冲液补至0.5 mL）；

2.4 待全部血清/血浆经过筛板进入分离柱后，加入2.5 mL缓冲液；

2.5 待上一步缓冲液全部经过筛板进入分离柱后，加入1 mL缓冲液，与此同时收集1 mL的洗出液，该液中富含天然活性的外泌体，可以应用于后续实验，也可以-80℃冻存备用。

3 分离后处理：

3.1 完成外泌体分离后，分批加入共30 mL缓冲液清洗分离柱；

3.2 如果需要继续使用分离柱分离血清/血浆外泌体，重复操作步骤2.3-2.5即可；

3.3 如果不需要继续使用分离柱分离血清/血浆外泌体，先加入5 mL 0.1 M NaOH清洗分离柱，再分批加入共20 mL缓冲液清洗和平衡分离柱，然后加入5 mL 20% 乙醇清洗分离柱，清洗完毕时盖上分离柱白色底盖；最后加入2 mL 20% 乙醇保湿，盖上并塞紧分离柱红色上盖，分离柱常温保存。

TIPS：

1. 本产品分离不同血清/血浆的外泌体时，洗脱曲线和纯度略有不同，但不影响大体趋势。

2. 样本量大或样本中外泌体含量低时，可以先浓缩样本再使用分离层析柱分离外泌体。

3. 本产品分离血清/血浆外泌体过程中应避免分离柱中液体长时间断流。

4. 本产品使用过程中，同一根柱子请勿分离不同来源的生物样本，同一根柱子请勿重复使用超过5次。

5. 本产品适宜常温保存和使用，应避免低温使用和高温加热。

6. 实验过程中请穿实验服并戴一次性手套，避免污染，确保安全。

二、外泌体分离层析柱（细胞上清）
操作步骤

1 细胞上清浓缩：

1.1 将细胞上清类生物样本使用0.22 μm的滤膜过滤，初步纯化备用；

1.2 细胞上清类生物样本和细胞上清浓缩剂等体积混合，剧烈涡旋振荡15 s后，4℃冰箱静置2h；

1.3 将混合液置于离心机中，4℃、10000×g 离心60 min；丢弃上清液；

1.4 加入细胞上清类生物样本总体积5%的PBS缓冲液，充分重悬离心沉淀；

1.5 重悬液富含外泌体，可以应用于后续实验，也可以-80℃冻存备用。

2 外泌体纯化准备：

2.1 自备常温、无菌的缓冲液，如PBS（推荐Y4213）；

2.2 自备常温、无菌的0.1 M NaOH、20% 乙醇；

2.3 使用分离柱前，取下分离柱红色上盖，将分离柱置于支架（推荐Y6074）待用；

3 外泌体分离：

3.1 准备细胞上清浓缩剂浓缩重悬后的外泌体样本，备用；

3.2 取下分离柱白色底盖，待柱内保护液流出后，分批加入共30 mL的缓冲液清洗分离柱；

3.3 待筛板上方缓冲液全部进入分离柱后；取0.5 mL步骤3.1中备用外泌体样本加在筛板中央，（不足0.5 mL加入缓冲液补至0.5 mL）；

3.4 待全部外泌体样本经过筛板进入分离柱后，加入2.5 mL缓冲液；

3.5 待上一步全部缓冲液经过筛板进入分离柱后，加入1 mL缓冲液，与此同时收集1 mL的洗出液，该液中富含天然活性的外泌体；可以应用于后续实验，也可以-80℃冻存备用

4 分离后处理：

4.1 完成外泌体分离后，分批加入共30 mL缓冲液清洗分离柱；

4.2 如果需要继续使用分离柱分离细胞上清外泌体，重复操作步骤3.3-3.5即可；

4.3 如果不需要继续使用分离柱分离细胞上清外泌体，先加入5 mL 0.1M NaOH清洗分离柱，再分批加入共20 mL缓冲液清洗和平衡分离柱，然后加入5 mL 20% 乙醇清洗分离柱，清洗完毕时盖上分离柱白色底盖；最后加入2 mL 20% 乙醇保湿，盖上并塞紧分离柱红色上盖，分离柱常温保存。

TIPS：

1. 本产品分离不同细胞上清的外泌体时，洗脱曲线和纯度略有不同，但不影响大体趋势。

2. 本产品分离细胞上清外泌体过程中应避免分离柱中液体长时间断流。

3. 本产品使用过程中，同一根柱子请勿分离不同来源的生物样本，同一根柱子请勿重复使用超过5次。

4. 本产品适宜常温保存和使用，应避免低温使用和高温加热。

5. 实验过程中请穿实验服并戴一次性手套，避免污染，确保安全。

三、外泌体浓缩液

1 样品预处理：

1.1 低含量外泌体类生物样本（以“细胞上清”为例）：取细胞上清，4℃，3000×g 离心10 min去除细胞碎片；取上清，4 ℃，10,000×g 继续离心 20 min，取上清，使用0.22 μm的滤膜过滤，初步纯化备用。

1.2 高含量外泌体类生物样本（以“动物血清”为例）：取动物血清，4℃，3000×g 离心 10 min；取离心上清，4℃，10,000×g离心 20 min，取离心上清使用0.22 μm的滤膜过滤，初步纯化后，按动物血清体积：1×PBS体积=1:9的比例稀释动物血清备用。

2 外泌体浓缩：

2.1 取处理后的生物样本，与外泌体浓缩液等体积混合，剧烈涡旋振荡15 s-60 s后，4℃冰箱静置2h；（可选：静置期间每30 min涡旋振荡一次；）

2.2 将混合液置于离心机中，4℃、10000×g离心60 min；丢弃上清液。

2.3 按外泌体浓缩液体积：1×PBS 体积=100:1的比例，加入预冷PBS缓冲液，充分重悬离心沉淀（注：此时相当于浓缩100倍，可跟进需求加入不同体积的PBS重悬）。

2.4 将重悬液转移至1.5 mL离心管中，置于离心机中，4℃、12000 rpm离心5 min；收集上清液。

2.5 该上清液富含外泌体，可以应用于后续实验，也可以分装并-80℃冻存备用。

TIPS：

1. 本产品可以长期常温稳定保存，使用前请摇晃混匀。

2. 本品可作为Y4124外泌体分离层析柱（细胞上清）中细胞上清浓缩剂的补充剂。

3. 实验过程中请穿实验服并戴一次性手套，避免污染，确保安全。