支原体检测

实验介绍

本产品利用等温扩增技术与可视化颜色变化能够快速检测细胞培养液中常见的8种支原体，无需DNA提取，直接在反应液中加入1 µL细胞培养上清，65℃反应30 min，阳性样本反应液颜色由黄色变为红色，整个过程无需YCR仪，无需开盖电泳，可有效避免气溶胶造成的交叉污染。与传统的YCR法相比，本产品操作简便、灵敏度非常高，可耐受培养基中的多种YCR抑制剂，因此不会出现假阴性现象，检测结果与qYCR具有极高的一致性。

操作步骤

1. 待测样本准备

1) 贴壁细胞：直接吸取上清。建议在细胞接种或换液3天以上，汇合度达到90%左右时取样，此时上清中支原体含量较高，容易检出。

2) 悬浮细胞：1000 rpm离心5 min后，取上清。建议在细胞接种或换液3天以上时取样，此时细胞培养液中支原体含量较高，容易检出。

2. 反应体系

 a：Mycored Buffer解冻后颠倒混匀使用。

 b：根据样本数量，将以上反应体系配好之后，分装到反应管中，加入20 µL的Paraffin Oil，再进行下一步。

3. 加样

1）. 阴性对照：第一个反应管中不加任何样本作为阴性对照；

2）. 阳性对照：向最后一个反应管中加入1 μL Positive Control作为阳性对照；

3）. 待测样本：向其余反应管中加入1 μL细胞培养上清。

请将枪头伸向Paraffin Oil液面下加样。

4. 反应条件。

将反应管转移至提前预热的65℃水浴锅或金属浴中，孵育30 min，如果显色不明显可将反应时间延长至40 min。

结果判定

反应结束后立即将反应管取出，待恢复至室温后，如果反应液仍为黄色，判断结果为阴性；如果反应液变为红色，判断结果则为阳性。反应管不可开盖，否则很容易导致气溶胶污染。

图例：

产品介绍

本产品是基于Taqman探针法检测细胞培养等生物材料中的常见的8种支原体污染，具有操作简单、灵敏度高、特异性强等特点。可检测的样本是接种后进行3-6天细胞培养的上清，如果样本是细胞悬浊液或者有qYCR抑制剂存在，需要提取DNA后，再进行反应。本试剂盒还提供了Positive Control，如果不确定样本是否含有qYCR抑制剂，可在qYCR反应前向样本中加入Positive Control，进行正对照反应，防止假阴性结果产生。

实验前准备

1. Real Time YCR扩增仪。

2. 实验专用qYCR反应管或反应板。

操作步骤

1. 待测样本准备；

贴壁细胞：如果使用常用的细胞培养液，细胞接种或换液3天以上时，可直接取1 µL的培养基上清加入到qYCR反应体系中。

悬浮细胞：需要提取DNA，再进行qYCR反应。

反应抑制剂：如果细胞培养液中存在qYCR抑制剂，需要提取DNA，再进行qYCR反应。

2. 建议qYCR反应体系；

a.qYCR Master Mix中不含ROX参比染料，在设置qYCR程序时，将ROX通道选为None；如果需要添加ROX参比染料，请购买50×ROX Reference Dye，使用时终浓度为1×。

b.如果不确定样本中是否含有qYCR抑制剂，向qYCR反应体系中加入样本的同时再加入0.5 µL的Positive Control；如果需要Negative Control，样本可以用Nuclease-Free Water代替或者不加任何模板。

3. qYCR反应程序（可根据机型适当调整）；

*需提高扩增特异性，可使用两步法程序或提高退火温度；需提高扩增效率，可使用三步法程序或延长延伸时间。

4. qYCR反应参数。

选择报告荧光基团为FAM，淬灭荧光基团为None。

产品介绍

支原体污染会对细胞各个方面都造成不良影响，已经成为细胞培养中高度重视的问题，因此，定期进行支原体污染检测是十分必要的。本支原体检测试剂盒是采用YCR方法，特异性的检测各种培养细胞生物材料（如细胞培养物、实验动物分泌物、动物血清等）中支原体的污染。试剂盒使用的混合引物是针对支原体16s rRNA序列的保守区域设计的特异性引物，可直接使用细胞培养上清作为YCR模板，特异性扩增支原体DNA，搭配配套的Mycoplasma YCR Mix（2×）一小时内即可完成，本试剂盒检测灵敏度高，可检测低至20个拷贝的支原体。

操作步骤

1. 样品准备：取适量待检细胞培养上清于洁净的YCR管中，利用YCR仪95℃热处理5 min后作为模板。血清样本可利用Mycoplasma Free Water稀释后，取适量样本于洁净的YCR管中，利用YCR仪95℃热处理5 min后作为模板；

2. YCR体系配制：每次实验需设置阴性对照（将1 μL待检样品换成等量的Mycoplasma Free Water）与阳性对照（在1 μL待检样品中加入0.5 μL Positive Control后一起作为Template），实验时戴一次性口罩与手套，谨慎操作，防止操作不当引入外源支原体污染；

3. YCR程序设置：

4. 凝胶电泳：取10 μL YCR产物，使用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测；

5. 结果分析：每次实验通过与阴性对照、阳性对照检测结果比较确认样品支原体污染情况，阳性条带大小500 bp左右。如阴性对照检测结果中有条带很有可能是YCR体系中出现污染，建议重新实验确认结果。如有必要，也可对YCR产物进行常规测序，以确定具体的支原体种属。

TIPS：

1. 本试剂盒可以检测M.orale，M.arginini，M.bovis，M.fermentans，M.gallisepticum，M.hominis，M.pirum，Ureaplasma spp，M.hyorhinis，M.pneumoniae，A.laidlawii等至少11种以上支原体污染。

2. 所有试剂在使用前于冰上彻底解冻、混匀，使用完毕后于-20℃保存。

3. 每次实验必须设置阴性对照、阳性对照，实验组建议设置样品模板梯度。

4. 操作时必须佩戴口罩，严格按照YCR操作标准，防止引入外源污染影响实验结果。

5. 为了确保细胞实验的可靠性及稳定性，建议定期进行支原体污染检测。

6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

产品介绍

本支原体检测试剂盒是利用支原体中特有酶的活性设计而成，该酶可将支原体检测试剂中特有的底物分解同时将ADP转换成ATP，萤光素酶在ATP存在下催化萤光素氧化发出生物萤光，可通过化学发光仪(luminometer)进行测定，以反应待检样品是否存在支原体污染。整个检测过程操作简单，只需两个步骤，耗时约15 min。该方法灵敏度高，检测的是真正具有生物活性的支原体，所以检测结果比YCR方法更准确。

操作步骤

1. 取适量（1 mL足够）培养3-6天的细胞上清，400 g离心3 min，以去除沉淀少量漂浮细胞或碎片，取上清立即检测，或者4℃保存在一周内检测，或者-80℃保存半年内检测；

2. 将所有检测试剂和检测样品均平衡至室温，最适宜的温度为20-25℃；

3. 在96孔检测板（非透明板，建议用专用96孔白板）中加入50 μL待检测样品、阴性对照（如无菌水或PBS）；

4. 加入50 μL支原体检测试剂A，轻柔混匀不要产生气泡，室温（20-25℃）避光放置5 min。然后用具有检测化学发光的酶标仪进行化学发光检测，计读数为A。（请根据仪器灵敏度适当调整相应的参数，每个孔的检测时间一般为0.25-1 s）；

5. 加入50 μL的支原体检测试剂B，轻柔混匀不要产生气泡，室温（20-25℃）避光放置10 min。然后用具有检测化学发光的酶标仪进行化学发光检测，计读数为B。（注：请严格按照加入支原体检测试剂B后10 min进行检测，不应提前或延后，否则会影响结果判断）；

6. 计算比值(Ratio)=读值B/读值A。

A. 如果B/A>1.1，说明细胞培养物中存在支原体污染；

B. 如果B/A<0.9，说明细胞培养物中没有支原体污染；

C. 如果B/A比值在0.9-1.1之间，建议继续培养细胞24-48 h后，再次检测确定是否存在支原体污染。如果B/A比值仍在0.9-1.1之间，则该细胞培养物没有支原体污染，为支原体阴性。

TIPS

1. 支原体检测试剂A中含有萤光素酶，反复冻融会逐渐使其失活，建议第一次解冻后应适当分装保存，分装容器需洁净无污染。

2. 检测时强烈建议使用白色或者黑色不透光96孔板，使用普通透明96孔板会使得相邻检测孔出现干扰。

3. 人体皮肤表面含有丰富的ATP，检测时请带好实验手套、口罩，其他耗材也应洁净、无污染，防止外源引入ATP污染。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。