拓扑克隆

相关产品

货号	名称	规格	价格
Y3033-25T	pSWE-Topo Zero Cloning Kit	25 T	600
Y3641-100T	高纯度质粒DNA小量提取试剂盒	100 T	300
Y3656-10T	无内毒素质粒DNA大提试剂盒	10 T	1080
Y3657-50T	无内毒素质粒DNA小提试剂盒	50 T	420
Y3659-10T	无内毒素质粒DNA中提试剂盒	10 T	600
Y3660-10T	质粒DNA中提试剂盒	10 T	480
Y3694-10T	质粒DNA大提试剂盒	10 T	660
Y3611-100T	磁珠法质粒DNA小量提取试剂盒	100 T	360
Y3621-10T	磁珠法高纯度质粒DNA大量提取试剂盒	10 T	960
Y3696-50T	无内毒素质粒DNA小提中量试剂盒	50 T	480
Y3699-100T	快速质粒DNA小量提取试剂盒	100 T	384
Y3114-100ML	LB液体培养基（无菌）	100 mL	36
Y3115-0910	LB琼脂平板	10 plates	108
Y3116-0910	LB琼脂平板（卡那抗性）	10 plates	120
Y3117-0910	LB琼脂平板（氨苄抗性）	10 plates	120
Y3118-0910	LB琼脂平板（氨苄+卡那抗性）	10 plates	132
YGQ-08	PCR-8联管压/起盖器	个	180
YLX-1024F	离心机微量高速低温型	台	31200
YT-9600	PCR仪	台	33600
YVL-2	一体式水平电泳仪（电泳槽＋蓝光仪）	台	1800

实验步骤

分子克隆效果图_画板 2.jpg

零背景Topo克隆与TA克隆的比较
类型	反应温度	反应时间	阳性率
零背景Topo（Y3033-25T）	室温（20-37℃）	5-10 min	☆☆☆☆☆
TA克隆	16℃	过夜	☆☆☆☆

1 、YCR产物的准备

（1）引物不能磷酸化；

（2）YCR反应使用高保真及Taq DNA Polymerase均可（推荐Y3315-01、Y3316-01）；

（3）YCR产物推荐电泳后使用凝胶回收试剂盒进行纯化（推荐Y3642-100T）。

2、参考反应体系：

Component	Volume
pSWE-Topo Zero Vector (50 ng/μL)	1 μL
基因片段	0.5-4 μL

插入片段推荐用量：载体与片段摩尔比=1:10-1:3。可以粗略地按照1 kb片段加入50 ng的量计算。如果构建基因文库可适当扩大反应体系。

3、按上述参考反应体系轻轻混合载体与基因片段，室温（20-37℃）反应5-10 min，将离心管置于冰上。

4、转化：a.在反应体系中加入50-100 μL克隆感受态（或将反应产物加入50-100 μL克隆感受态中），轻轻混匀，冰浴30 min；b.将转化体系立即于42℃热激45 s，立即置于冰上2-3 min；c.在转化体系中加入200 μL平衡至室温的SOC或LB培养基，200 rpm、37℃孵育1 h；d.取200 μL菌液涂布抗性平板，37℃倒置培养过夜（为得到较多克隆，可以离心后去掉部分上清，将菌液全部涂布抗性平板）。

5、阳性转化子检测：

a. 菌落YCR鉴定阳性克隆：挑取单克隆至10 μL无菌水中，涡旋混合，然后取1 μL混合液作为YCR模板，M13 Forward Primer和M13 Reverse Primer作为通用引物，进行菌落YCR鉴定阳性克隆。（推荐Y3315、Y3316；YCR反应体系及程序参考相应产品说明书，阳性克隆YCR扩增片段＞100 bp）

b. 酶切鉴定阳性克隆：挑取单克隆接种于适量抗性液体培养基中，220rpm、37℃过夜培养。小量提取质粒，用适宜的限制性内切酶进行酶切，凝胶电泳鉴定阳性克隆。

c. 测序鉴定阳性克隆：使用M13 Forward Primer，M13 Reverse Primer引物测序并分析。