外周血信号通路检测方法

外周血信号通路检测方法

A. 所需溶液和试剂

1. 10X磷酸盐缓冲液（10X PBS）：在800 ml蒸馏水中加入80 g 氯化钠（NaCl），2 g 氯化钾（KCl），14.4 g 磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）和2.4 g 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）。调节pH到7.4，定容至1 L。
2. 甲醛溶液（无甲醇的）
3. 孵育缓冲液：50 mM EDTA pH 8.0

B. 用于免疫染色的全血处理（固定，裂解以及细胞膜打孔）

1. 各测试管中均加入100 μl新鲜全血。
2. 可选：将测试管插在37°C水浴锅的架子上，用配体、抑制剂、药物等试剂进行短时间处理。
3. 各测试管中均加入65 μl 10%甲醛溶液。
4. 稍加涡旋震荡，室温静置15分钟。
5. 在PBS中加入1 ml Triton X-100，终浓度为0.1%。
6. 涡旋震荡后室温静置30分钟。
7. 添加1 ml孵育缓冲液。
8. 离心沉淀细胞，去除上清。
9. 将细胞重悬在含50%甲醇的冰冷PBS溶液中（50%甲醇PBS溶液储存在–20°C，待用）。
10. 在冰上至少放置10分钟。
11. 继续染色，或将重悬在50%甲醇PBS溶液中的细胞保存在 –20°C，待用。

C. 用未标记的一抗和标记的二抗进行染色

1. 各测试管中加入1 ml孵育缓冲液漂洗，离心回收细胞。重复一次。
2. 按照说明书上推荐的稀释比例向孵育缓冲液中加入一抗。
3. 室温孵育30–60分钟。
4. 离心回收细胞。同第一步，用孵育缓冲液漂洗一次，离心回收细胞。
5. 根据厂家推荐，用孵育缓冲液稀释荧光素标记的二抗，重悬细胞。
6. 室温孵育30分钟。
7. 离心回收细胞。同第一步，用孵育缓冲液漂洗一次，离心回收细胞。
8. 将细胞重悬在0.5 ml PBS中，利用流式细胞仪进行分析。

参考文献：Chow S, Hedley D, Grom P, Magari R, Jacobberger JW, Shankey TV (2005) Whole blood fixation and permeabilization protocol with red blood cell lysis for flow cytometry of intracellular phosphorylated epitopes in leukocyte subpopulations. Cytometry A 67(1), 4–17.

*推荐的二抗：

抗兔

Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412

Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) #4413

Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414

抗小鼠

Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4408

Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) #4409

Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4410

抗大鼠

Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4416

Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor® 555 Conjugate) #4417

Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4418