“酶”处理染色质免疫沉淀（琼脂糖微球式）操作方法

“酶”处理染色质免疫沉淀（琼脂糖微球式）操作方法

所需试剂

包含在试剂盒 SimpleChIP™ Enzymatic Chromatin IP Kit （Agarose Beads） #9002中的试剂：

1. 甘氨酸溶液（10X）
2. 缓冲液A（4X）
3. 缓冲液B（4X）
4. ChIP缓冲液（10X）
5. ChIP洗脱（缓冲）液（2X）
6. 5 M NaCl
7. 0.5 M EDTA
8. 1M DTT
9. DNA结合（缓冲）液
10. DNA漂洗（缓冲）液
11. DNA洗脱（缓冲）液
12. DNA纯化柱
13. 蛋白酶混合抑制剂（200X）
14. 核糖核酸酶A（10 mg/ml）
15. 微球菌核酸酶（2000 gel units/μl）：NEB #M0247S
16. 蛋白酶K（20 mg/ml）：NEB #P8102S
17. 人对照基因RPL30外显子3引物
18. 小鼠对照基因RPL30内含子2引物
19. 组蛋白H3（D2B12）XP™兔单抗（ChIP专用） #4620
20. 正常兔IgG #2729
21. ChIP级蛋白G琼脂糖微球 #9007

不包含在试剂盒SimpleChIP™ Enzymatic Chromatin IP Kit （Agarose Beads） #9002中的试剂：

1. PMSF （0.1 M，溶剂乙醇）
2. 37%的甲醛溶液
3. 乙醇（96-100%）
4. 1X PBS
5. 无核酸酶的水
6. Taq DNA聚合酶
7. dNTP（三磷酸脱氧核苷酸）混合液

A.     体内交联，细胞核制备并用核酸酶S7消化染色质

开始之前：

每次实验需要刺激或处理大约4X 10⁷个细胞。这些细胞中提取的染色质可以用于多达10次单独的免疫沉淀实验。

• 以Hela细胞为例，这相当于5个15 cm培养皿中细胞密度达到90%时的总细胞数（一般每个盘中的培养基为20 ml）。
• 另外准备一盘细胞用于血球计数板法测定细胞数。

取出并需预热的试剂：

• 200X蛋白酶混合抑制剂
• 1 M的二硫苏糖醇
• 0.1 M PMSF （自备）
• 10X ChIP缓冲液（使用前请确认SDS已完全溶解）。

为每4 X 10⁷细胞准备以下试剂，并在冰上预冷（5个培养皿）：

·         10 ml 10X 甘氨酸溶液

·         200 ml 1X PBS（自备）

·         10 ml 1X PBS + 100 μl PMSF 

·         10 ml 1X 缓冲液 A （2.5 ml 4X缓冲液 A + 7.5 ml 水） + 5 µl 1 M DTT + 50 µl 200X 蛋白酶混合抑制剂l （PIC） + 100 µl PMSF

·         11 ml 1X 缓冲液 B （2.75 ml 4X 缓冲液 B + 8.25 ml 水） + 5.5 µl 1 M DTT

·         1 ml 1X ChIP 缓冲液 （100 µl 10X ChIP 缓冲液 + 900 µl 水） + 5 µl 200X 蛋白酶混合抑制剂 （PIC） + 10 µl PMSF.

1. 为了使蛋白与DNA交联，向每个含有20 ml培养基的15cm培养皿中加入540 µl 37%的甲醛溶液。稍加转动培养皿使之混匀，室温放置10分钟。
   • 甲醛的终浓度为 1%.
   • 使用新鲜未过产品保质期的甲醛溶液
   • 加入甲醛后，培养基的颜色会发生改变。
2. 每个盘中加入2 ml 10X 甘氨酸溶液稍加转动使之混匀，室温孵育5分钟。
   • 加入甘氨酸后，培养基的颜色会发生改变。
3. 对于贴壁细胞，弃去培养基后用冰冷的PBS漂洗两次（20 ml /次），彻底弃净PBS。对于悬浮细胞，4℃ 1500rpm离心5分钟，沉淀用冰冷的PBS漂洗两次。
4. 每盘细胞中加入2 ml冰冷的1X PBS + PMSF，将细胞刮下并将5盘细胞收集到一个15 ml的锥底管中。悬浮细胞直接将细胞重悬到2 ml的冰冷缓冲液中合并即可。
5. 4°C 1500rpm离心5分钟。弃上清，并将细胞重悬在10 ml冰冷缓冲液 A + DTT + PIC + PMSF中。冰上孵育10分钟。每3分钟颠倒混匀一次。
6. 4°C 3000rpm离心5分钟以沉淀细胞核。弃上清，并将沉淀重悬在10 ml冰冷的缓冲液B + DTT中。再次离心，弃上清，并将沉淀重悬在1.0 ml 缓冲液 B + DTT中。将样品转移到1.5 ml离心管中。
7. 加入5 µl微球菌核酸酶，颠倒混匀数次，37°C孵育20 min，每隔3~5分钟颠倒混匀一次，将DNA消化成长度约为150-900 bp的片段。
   • 需要做预实验确定将不同细胞系DNA酶切到理想长度所需微球菌核酸酶的酶量（参照附录A）。
   • 4 X 10⁷个HeLa细胞核用5 µl微球菌核酸酶在1 ml缓冲液 B + DTT中消化可以得到合适长度的DNA片段。
8. 加入100 µl 0.5 M EDTA终止消化，将离心管置于冰上。
9. 4°C 13000rpm离心1分钟，沉淀细胞核。弃上清。
10. 将细胞核沉淀重悬在1 ml 1X ChIP 缓冲液 + PIC + PMSF中，然后将样品一分为二，向两个离心管各分装500 µl。冰上孵育10分钟。
11. 对每管细胞核样品用超声波处理数次以破碎核膜。在每次超声处理操作之间，将样品在冰上孵育30秒。
    • 可以在超声前后利用光学显微镜观察细胞核以判断完全破碎细胞核所需的最佳条件。
    • 利用VirTis Virsonic 100超声破碎仪，设置模式6，1/8英寸的探头，对Hela细胞核进行每次20秒，共3次的超声处理可以达到完全破碎的效果。
    • 或者也可以用杜恩斯型匀浆器处理细胞核20次，但是这种破碎效果可能不如超声处理完全。
12. 4°C 10000rpm离心10分钟，使样品澄清。
13. 将上清转移到一个新管子中，即为交联的染色质样品。在下一步使用之前需要保存在-80°C。取50 µl用以分析DNA的酶切情况并确定其浓度（参照B部分）。

B. 分析染色质的浓度和酶切情况（推荐步骤）

1. 向50 µl的染色质样品中（来自A部分第13步）加100 μl无核酸酶的水，6 μl 5 M NaCl 和 2 μl RNAse A。涡旋震荡混匀， 37°C孵育30分钟。
2. 向RNAse A消化后的样品中加入2 μl 蛋白酶K。涡旋震荡混匀， 65°C孵育2小时。
3. 按照F部分的说明利用离心柱纯化DNA。
4. DNA样品纯化后，取10 µl与1 kb DNA Marker进行1%琼脂糖凝胶电泳以确定DNA片段大小。DNA应当被酶切成长度约为150-900 bp的片段（1~5个核小体长度）
5. 测定DNA浓度时，将2 µl纯化后的DNA加入到98 µl TE缓冲液中（即稀释50倍），然后读取OD_260吸收值。将OD₂₆₀乘以2500即得到以μg/ml表示的DNA浓度。理想的DNA浓度应当在100~200 μg/ml之间。

注意：要得到理想的ChIP结果，合适长度和浓度的染色质样品至关重要。过度消化可能会减弱PCR定量信号。而消化不足可能会导致过高的背景信号并降低分辨率。加入到IP体系中的染色质太少也可能导致不能产生PCR定量信号。优化染色质消化条件的操作方法请参照附录A。

C. 染色质免疫沉淀

开始之前：

从冰箱中取出并预热：

• 200 X 蛋白酶混合抑制剂
• 交联的染色质样品（来自A部分第13步）
• 10 X ChIP 缓冲液（使用前请确认SDS已完全溶解）

从冰箱中取出并置于冰上

• ChIP级的G蛋白琼脂糖微球 #9007
• 免疫沉淀所用的抗体，包括阳性对照组蛋白H3 （D2B12） XP™ 兔单抗 （ChIP专用） #4620，和阴性对照抗体正常兔IgG #2729。

注意：交联的染色质样品也可以不按照下面的描述稀释，将抗体直接添加到未稀释的染色质样品中沉淀染色质复合物。

1. 在一个样品管中先为所需的免疫沉淀反应准备足够的1 X ChIP缓冲液。每个沉淀反应需要400 μl 1 X ChIP 缓冲液（40 µl 10X ChIP缓冲液 + 360 µl水）和2 µl的蛋白酶混合抑制剂。在确定免疫反应数时，应当包括阳性对照组蛋白H3 （D2B12） XP™ 兔单抗 （ChIP专用） #4620和阴性对照抗体正常兔IgG #2729样品。混匀后置于冰上。
2. 在配好的ChIP缓冲液中，每反应加入100μl交联后的染色质样品（10~20ug的染色质DNA，来自A部分第13步）。例如， 10个免疫沉淀反应就需要准备一个含有4 ml 1 X ChIP 缓冲液的离心管（400 µl 10 X ChIP 缓冲液 + 3.6 ml 水）+ 20 μl 蛋白酶混合抑制剂 + 1 ml 消化后的染色质样品。
3. 吸取10 µl稀释后的样品并转移到一个微量离心管中。这就是2%样品输入对照，使用之前可以保存在-20°C （用于E部分的第一步）。
4. 分装每个免疫沉淀反应所需要的500 µl稀释的染色体样品到各个离心管中并加入对应的抗体。每种抗体做免疫沉淀时所需用量有差异，需要用户在使用时加以调整。对于阳性对照组蛋白H3 （D2B12） XP™ 兔单抗 （ChIP专用） #4620，加入10 µl即可。对于阴性对照正常兔IgG #2729，需加1 µl （1 µg）~5 µl （5 µg）。在4°C的转子上孵育4小时以上或过夜。
5. 加入30 μl的ChIP级的蛋白G琼脂糖微球 #9007，在4°C的转子上孵育2小时。
6. 开始D部分操作。

D. 漂洗免疫沉淀的染色质：

开始之前：

从冰箱中取出并预热：

• 10X ChIP 缓冲液并确认SDS已完全溶解

为每个免疫沉淀反应准备并在冰上预冷：

• 低盐漂洗液: 3 ml 1 X ChIP缓冲液 （300 µl 10 X ChIP缓冲液 + 2.7 ml水）
• 高盐漂洗液: 1 ml 1 X ChIP 缓冲液（100 µl 10 X ChIP 缓冲液 + 900 µl 水） + 70 µl 5M NaCl

1. 4°C 6000rpm，离心1分钟，沉淀每个样品（来自C部分第5步）中的蛋白G琼脂糖微球，并除去上清。
2. 加入1 ml低盐漂洗液重悬微球，在4°C转子上孵育5分钟。再重复第1步和第2步两次，即总共用低盐漂洗液洗三次。
3. 加入1 ml高盐漂洗液重悬微球，在4°C转子上孵育5分钟。立即进入E部分第二步。

E. 将染色质从抗体/蛋白G微球上洗脱并解交联

开始之前：

• 从冰箱中取出并在37°C水浴中预热2 X ChIP洗脱缓冲液并确认SDS已完全溶解。
• 将水浴锅或温控混匀器设定到65°C。
• 为每份洗脱下来的样品（D部分第3步所得）和2%的样品输入对照（C部分第3步所得）准备150 µl 1 X ChIP洗脱缓冲液（75 µl 2 X ChIP洗脱缓冲液 + 75 µl 水）

1. 取150 µl 1 X ChIP洗脱缓冲液加入到2%样品输入对照中，室温放置直到开始第7步。
2. 6000rpm离心1分钟，沉淀蛋白G琼脂糖微球并除去上清。
3. 每份免疫沉淀样品中加入150 μl 1 X ChIP 洗脱缓冲液。
4. 用涡旋混合器轻轻震荡（1200 rpm），65°C孵育30分钟将染色质从抗体/蛋白G微球上洗脱下来。此步用温控混匀器效果最好。当然，洗脱也可以在室温下的转子上进行，但洗脱效果可能不如温控混匀器完全。
5. 6000rpm离心1分钟，沉淀蛋白G琼脂糖微球。
6. 小心地将洗脱下来的染色质上清转移到一个新的离心管中。
7. 在所有管中，包括第一步的2%样品输入对照，都加入6 µl 5 M NaCl和2 µl 蛋白酶K并在65°C孵育2小时。
8. 开始F部分的操作。

F. 用离心柱纯化DNA。

开始之前：

• 使用前，在DNA漂洗液中加入24 ml的乙醇（96-100%）。乙醇只需添加一次，在第一次使用DNA漂洗液之前完成这一步即可。
• 为E部分得到的每一个DNA样品准备一套DNA离心柱和收集管。

1. 向每个DNA样品中添加750 µl DNA结合缓冲液，涡旋混匀器稍加震荡。
   • 每一份的样品需要添加五份的DNA结合缓冲液
2. 将DNA离心柱插入到收集管中并做标记，每个样品吸取450 µl分别上样到各自的离心柱中。
3. 14000rpm离心30秒。
4. 把离心柱从收集管中取出，倒掉废液。将离心柱插回到收集管中。
5. 将第1步中剩余的450 µl样品添加到相应的离心柱中，重复第4和第5步。
6. 在离心柱中加入750 µl的DNA漂洗缓冲液。
7. 14000rpm离心30秒。
8. 把离心柱从收集管中取出，倒掉废液。将离心柱插回到收集管中。
9. 14000rpm离心30秒。
10. 取出离心柱，插入到干净的1.5 ml离心管中，将收集管和废液一起丢弃。
11. 在每个离心柱中加入50 µl DNA 洗脱缓冲液。
12. 14000rpm离心30秒，洗脱DNA。
13. 取出并丢弃DNA离心柱。离心管中的洗脱液即为纯化的DNA。样品可以保存在-20°C。

G. 用PCR定量DNA：

建议：

• 实验中使用带滤芯的枪头以尽可能减少污染的可能性。
• 试剂盒中所包含的对照引物特异性识别人或小鼠的RPL30基因，既可以用于常规PCR也可以用于实时定量PCR。如果用户做的ChIP样品来源于其它他物种，建议客户设计合适的特异对照引物并优化PCR反应条件。
• 建议使用热启动Taq聚合酶以减少产生非特异PCR产物的风险。
• PCR引物的选择很关键。引物应尽可能按照下列标准来设计：

常规PCR操作：

1. 按样品数取出合适数目的0.2 ml PCR管并做好标记。注意包括2%样品输入对照组，阳性对照组蛋白H3样品组，阴性对照正常兔IgG样品组，以及一个监控DNA污染的无DNA模板的空白组对照。
2. 在每管中加入2μl对应的DNA样品。
3. 按下面配比配置PCR反应液总管，记住计算时多算两份以补偿分管时的体积损失。配好后，向每个PCR管中加入18μl反应液混合物。

4. 设定并执行以下PCR反应程序：

5. 从每个反应管中取10 μl PCR产物，2%琼脂糖凝胶或10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，用100 bp DNA Marker做对照。人、小鼠RPL30的PCR产物大小分别为161、159 bp。

实时定量PCR方法：

1. 选与所用定量PCR仪配套的PCR管或板，做好标记。注意加入阳性对照组蛋白H3样品组，阴性对照正常兔IgG样品组，以及监控DNA污染的不加DNA模板的空白组对照。另外在加入反应体系前，将2%样品输入对照做一系列稀释（不稀释，1：5，1：25，1：125），据此可以产生标准曲线并测算PCR扩增效率。
2. 在每个反应管或孔（板上）中加入2 μl相应DNA模板。
3. 按下面配比配置PCR反应液总管，记住计算时多算两份以补偿分管时的体积损失。配好后，向每个PCR管中加入18 μl反应液混合物。

4. 按下面程序执行PCR：

5. 用定量PCR仪自带的程序分析定量结果。

附录A：染色质消化条件优化

将交联后的DNA消化成长度为150-900 bp片段所需最优条件取决于细胞类型、密度和微球菌核酸酶的浓度。以下操作步骤可以用于优化既定细胞类型和密度的消化条件。

1. 先用4 X 10⁷个细胞制备交联的细胞核，按照A部分第1到6步操作。
2. 将上述第6步得到的200 μl核提取物分装到5个不同的微量离心管中，置于冰上。
3. 把5 μl微球菌核酸酶加入到20 μl 1 X 缓冲液 B + DTT中（1：5稀释）。
4. 向第2步所得的5个微量离心管中分别加入0 μl，2.5 μl，5 μl，7.5 μl或10 μl稀释后的微球菌核酸酶，颠倒几次混匀，然后在37°C孵育20分钟，期间经常的颠倒混匀。
5. 加入20 μl 0.5 M EDTA终止消化，置于冰上。
6. 4°C 13000rpm离心1分钟，沉淀细胞核并去除上清。
7. 将细胞核沉淀用200 μl 1X ChIP 缓冲液 + PIC +PMSF重悬。在冰上放置10分钟。
8. 用超声波处理样品数次以破碎细胞核膜。在每次超声处理之间，将样品置于冰浴内降温30秒。
   • 可以在超声前后用显微镜观察核以判断完全破碎细胞核所需的最佳条件。
   • 利用VirTis Virsonic 100超声破碎仪，设置模式6，1/8英寸的探头，对Hela细胞核进行每次20秒，共3次的超声处理可以达到完全破碎的效果。。
   • 或者也可以用杜恩斯型匀浆器处理细胞核20次，但是这种破碎效果可能不如超声处理完全。
9. 4°C 10000rpm离心10分钟，使样品澄清。
10. 各取50 μl超声裂解物的上清转移到新的离心管中。
11. 向每个50 μl样品中加入100μl无核酸酶的水，6 μl 5 M NaCl 和 2 μl RNAse A。涡旋震荡混匀， 37°C孵育30分钟。
12. 向RNAse A 消化后的样品中加入2 μl 蛋白酶K。震荡混匀后在65°C孵育2小时。
13. 取20 μl样品、1 kb DNA marker跑1%琼脂糖胶电泳，观察酶切后DNA片段的大小。
14. 从电泳带型上判断何种消化条件生成所需要的150-900 bp带型（1~5个核小体长度）。优化所得稀释的微球菌核酸酶体积即为下一步实验中用于4 X 10⁷个细胞消化所用的微球菌核酸酶原液体积数。比如说，如果在本次实验中，用5 μl稀释后的微球菌核酸酶处理后得到150-900 bp带型，则在A部分的第7步则应加入5 μl微球菌核酸酶原液。
15. 假如结果显示所用条件未能达到理想的消化结果，则相应调整每组消化所用酶量，重做条件优化实验。

附录B:常见问题及解决方案