CST 免疫组化方法（冰冻切片）

A.     所需溶液和试剂

1. 二甲苯
2. 无水乙醇（100% 和 95%，变性无水乙醇，组织学级）
3. 苏木精（可选）
4. 固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。
   1. 10%中性福尔马林
   2. 丙酮
   3. 甲醇
   4. 3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。
5. 10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base ，C₄H₁₁NO₃）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6。
6. 漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。
7. 甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H₂0₂加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。
8. 封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。
9. 配制时，将500 µl山羊血清和30 µl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。
10. 检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。
11. DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。

B.      切片

1. 对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切片时样品断裂。
2. 将样品切成大约6-8 µm厚，铺在带正电性的玻片上。
3. 固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片）

C.     固定

注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂

1. 玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。
   1. 10%中性福尔马林：室温10分钟。立即进行染色操作。
   2. 冰丙酮：-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。
   3. 甲醇：-20°C 10分钟。立即进行染色操作。
   4. 3%甲醛溶液：室温15分钟。立即进行染色操作。
   5. 3% 甲醛/甲醇：先在室温下3%甲醛中固定15分钟，然后在-20°C的甲醇中固定5分钟（中间不漂洗）。立即进行染色操作。

D.     染色

1. 切片用漂洗液洗两次，每次5分钟。
2. 室温下，浸泡在3% H₂0₂/甲醇中孵育10分钟
3. 用漂洗液洗两次，每次5分钟。
4. 在切片上滴加封闭液，室温封闭1小时。
5. 按抗体说明书的推荐比例将抗体稀释在封闭液中。
6. 去掉切片上的封闭液，每个切片上加100-400 µl稀释的一抗。4°C孵育过夜。
7. 去掉抗体。用漂洗液洗3次，每次5分钟。
8. 根据厂家说明书，用合适的检测系统*检测。
9. 用漂洗液洗3次，每次5分钟。
10. 加入100–400 µl DAB或合适的底物，近距离检测染色进展。
11. 一旦切片染色成功，立刻将玻片浸入水中。
12. 如有需要，将切片泡在苏木精溶液中复染，按照产品说明进行。
13. 切片用蒸馏水洗两次，每次5分钟。
14. 切片脱水：
    1. 在95%乙醇中孵育两次，每次10秒。
    2. 在100%乙醇中孵育两次，每次10秒。
    3. 在二甲苯中孵育两次，每次10秒。
15. 加上盖玻片。