做Western免疫印迹时，将膜泡在用稀释抗体中4°C孵育过夜并轻轻晃动。抗体稀释在含5% w/v 脱脂奶粉的1X TBS, 0.1% Tween-20当中
注意：双荧光Western中两种一抗需要是不同物种来源的而且对应的二抗应标记有不同荧光。如果两种一抗相应推荐使用的一抗稀释液不同，则将两种抗体单独在两种稀释液中试验，选用效果更好的稀释液用于双荧光实验。
以下方法中的试剂可以根据货号从Cell Signaling Technology (CST)公司购得。
A. 所需溶液和试剂
注意：所有溶液用Milli-Q或相当级别的水配制。
- 1X磷酸盐缓冲生理盐水
- 1X SDS 上样缓冲液 (#7722, #7723) 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8，25°C), 2% w/v SDS, 10% 甘油, 50 mM DTT, 0.01% w/v 溴酚蓝或酚红。
- 转膜缓冲液：25 mM Tris 碱, 0.2 M 甘氨酸, 20% 甲醇 (pH 8.5)。
- 10X Tris缓冲盐水(TBS): 配制1L时，称取24.2g Tris碱，80g NaCl加入1L水中；调整pH为7.6（稀释至1X使用）。
- 脱脂牛奶: (#9999)
- 封闭液：含5% w/v脱脂奶粉，0.1% Tween-20的1X TBS。配150ml时，在135ml水中兑入15ml 10X TBS，混匀；加入7.5g脱脂奶粉，使之溶解。
- 漂洗液: 1X TBS, 0.1% Tween-20 (TBS/T)。
- Antibody Dilution Buffer: 1X TBS, 0.1% Tween-20 with 5% nonfat dry milk; for 20 ml, add 2 ml 10X TBS to 18 ml water, mix. Add 1.0 g nonfat dry milk and mix well. While stirring, add 20 μl Tween-20 (100%).
抗体稀释液：含5% w/v脱脂奶粉或BSA，0.1% Tween-20的1X TBS。配20ml时，在18ml水中兑入2ml 10X TBS，混匀；加入1gBSA或脱脂奶粉，使之溶解；边搅拌边加入20 μl Tween-20 (100%)，混匀。
- 预染蛋白分子量标，宽谱（预混型）: (#7720)。
印迹膜：本套方法为针对硝酸纤维素膜优化得到，CST推荐使用硝酸纤维素膜。
B. 蛋白印迹
样品制备的通用方法如下所述：
- 加入含调节因子的新鲜培养基处理所需的时间。
- 吸去培养基。用PBS清洗一次，吸去。
- 加入1X SDS样品缓冲液裂解细胞(6孔板中每孔加100 μl ，10cm盘中每盘加500 μl)
- 超声处理10–15秒打断DNA同时降低样品的粘度。
- 取20μl样品放在95–100°C加热5分钟，然后放在冰上冷却。
- 离心5分钟。
- 取20 μl加样到SDS-PAGE胶上(10 cm x 10 cm)。
注意：CST建议同时加上预染蛋白分子量标(#7720, 10 μl/泳道)以验证转膜成功并判断所得到条带的分子量。预染的分子量标在近红外的区域带有自发荧光。
- 将电泳后的蛋白电转移到硝酸纤维素膜或是PVDF膜上。
C. 膜封闭和抗体孵育
注意：以下所用试剂体积数为10 cm x 10 cm (100 cm2)膜的用量。使用不同大小的膜时，根据面积相应调整。
- （可选）转移后，室温下硝酸纤维素膜用25ml TBS清洗两次，每次5分钟。
- 将膜泡在25 ml封闭液中室温下孵育1小时。
- 用15 ml TBS/T清洗3次，每次5分钟。
- 把膜泡在按合适比例稀释的一抗溶液中4°C孵育过夜并轻轻晃动。
- 用15 ml TBS/T清洗3次，每次5分钟。
- 按1:5000-1:25,000稀释荧光素标记的二抗（原液1 mg/ml）在10 ml抗体稀释液中，室温孵育1小时并轻轻晃动。
- 用15 ml TBS/T清洗3次，每次5分钟。
B. 蛋白检测
- 将膜上剩余的TBS/T吸走并晾干。
- 用合适的荧光扫描仪按照使用说明对膜进行扫描。
|
