免疫组化

免疫组化原理
免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫 细胞化学技术(immunocytochemistry)。抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组 织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都 可用相应的特异性抗体进行检测。免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。免疫荧光法是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一，包括荧光抗体和荧光抗原技术，具有抗原抗体反应的特异 性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏性等优势。但是，由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜，荧光强度随时间的延长而逐渐 消退，结果不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定限制，而逐渐被免疫酶法所取代。
免疫组化优点
特异性强
免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
敏感性高
在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP法的出 现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。
定位准确、形态与功能相结合
该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入是十分有意义的。
免疫组化试剂准备
1. 0.01M(pH7.4)的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），稀释抗体和洗片子用；
2. 清洁液、纯水，洗玻片用
3. 多聚赖氨酸处理载玻片，防止脱片
4. 固定液4%多聚甲醛或冷丙酮等；
5. 15%~30%蔗糖，组织脱水用；
6. 梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，或者OCT包埋做冰冻切片；
7. 抗原修复液枸橼酸缓冲液（pH6.0）；
8. 活化剂EDTA或者Triton X-100；
9. 1%~10%牛血清清蛋白（BSA）封闭液；
10. H2O2，灭活内源性过氧化物酶；
11. 显色液根据你做的酶来选择，如果是HRP就用DAB，如果是AKP，就用NBT/BCIP，免疫荧光则不需要；
12. 50%缓冲甘油封片液。
载玻片的处理
抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。
具体方法如下
1. APES现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。
2. HistogripTM将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。
3. Poly-L-Lysine将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。
常用酶消化
1. 胰蛋白酶一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。
2. 胃蛋白酶一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。
3. 皂素（Saponin）一般使用浓度为2~10 μg/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。
抗原热修复
可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01 M枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000 ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 ± 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。
1. 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法切片脱蜡至水后，3％ H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。
2. 石蜡切片高压抗原修复操作方法切片脱蜡至水。将1500 ml~3000 ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。
3. 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。
免疫组化染色步骤（以美国ZYMED公司SP试剂盒为例）
1. 石蜡切片脱蜡至水。
2. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
3. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
4. 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5. PBS冲洗，5分钟×3次。
6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
7. PBS冲洗，5分钟×3次。
8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
9. PBS冲洗，5分钟×3次。
10. 显色剂显色（DAB或AEC）。
11. 自来水充分冲洗，复染，封片。
冰冻切片免疫组化染色步骤
冰冻切片4~8 mm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。
下接免疫组化染色操作步骤。
免疫组化常见问题的处理
当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。
对照/标本无染色
1. 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
2. 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。
3. 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
4. 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。
5. 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。
6. 检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。
7. 检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。
8. 检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。
9. 检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。
弱阳性
如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑
1. 标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。
2. 不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。
3. 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。
4. 切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。
5. 孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。
6. 如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。
非特异性染色
是否有效地去除了内源性酶和生物素。应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。处理的方法为
1. 灭活碱性磷酸酶最常用的方法是将左旋咪唑（24 mg/m1）加入底物液中，并保持pH值在7.6~8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50 mM的酒石酸抑制。
2. 饱和处理内源性生物素消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素，以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点。具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25 μg/ml亲和素溶液中处理15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。
1. 是否选择使用了正确的封闭血清。电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。有时其它无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用。另外，取材时避开出血、坏死区亦极重要。最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错。
2. 所选择的抗体是否符合试验要求。因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
1. 一抗的使用浓度是否过高。
2. 清洗是否充分。应严格操作规程。因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常0.05 M Tris-HCl，0.15 M NaCl已适用于多数染色方法，溶液内加入吐温20，效果更佳。特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。
3. DBA的使用是否正确。DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH值，以确保实验结果的正确性；粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H2O2。孵育时间过长也会造成背景染色。
1. 标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。
2. 检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。
免疫组化操作要点
3. 固定最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
PLP液即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
4. 组织脱水，透明时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
5. 切片时展片有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
6. 烤片60℃ 30分钟或37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
7. 蜡块及切片的保存最好在4℃保存
8. 脱片问题 Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法切片在脱蜡前，放在APES 150 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
9. 灭活内源性酶HRP系统3%双氧水灭活；AP系统3%HAc灭活。
10. 暴露抗原对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。
11. 封闭在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭
12. 抗体稀释应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。
13. 背景高在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。
14. 返蓝在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。
15. 显色一定要在显微镜下观察，注意控制背景。 DAB法 显示过氧化物酶
〔原理〕 过氧化物酶分解H2O2的过程中，下面反应不直接发生AH2（供氢体）+H2O2→A（供氢体的氧化物）+2H2O2实验可知，有称为复合物 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的酶——底物（受氢体）复合体生成，在复合体最后分解为酶和水时，游离的原子氧使供氢体氧化而显色。酶组织化学中所使用的供氢体应是含有色原性基团的发色物质，如奈酚和联苯胺。免疫组化染色步骤（以ABC法为例）
溶液的配置
16. 0.1M PBS 2000mlNaCL 18g, NaH2PO4•2H2O 0.8g, Na2HPO4•12H2O 12g. 共六份
17. 柠檬酸盐缓冲液
贮存液0.1M柠檬酸溶液（A）21.01g 柠檬酸 + 1L 蒸馏水
0.1M柠檬酸三钠溶液（B）29.41g 柠檬酸三钠 + 1L 蒸馏水
工作液9ml A液+41ml B液+450ml 蒸馏水→0.01M柠檬酸盐缓冲液
18. 0.03% H2O2-甲醇30% H2O2 0.4ml + 400ml 纯甲醇→充分混匀
19. 20% 甘油80ml 纯甘油 + 320ml 蒸馏水
20. 稀释抗体1︰300 ，1︰400 ，1︰600 （临用前配）
21. 酒精的配置
染色步骤一步法
22. 载玻片 烤箱中 60℃ 40′。
23. 二甲苯Ⅰ，60℃ 20′(水浴箱中)，二甲苯Ⅱ，室温 15′。
24. 脱水，100%→95%→85%→75%酒精，每级均为3′。
25. 蒸馏水冲洗，PBS 5′﹡1
26. 微波炉修复抗原0.01M 柠檬酸盐缓冲液，99℃ 肺 20′，心肾 12′
27. PBS 3′*3
28. 0.03% H2O2-甲醇，室温20′
29. PBS冲洗，PBS 3′*3，甩干或纸巾吸去多余液体（勿碰到组织），PAP Pen划境线。
30. block solution 封闭抗原，室温10′。
31. 倾出封闭液，不洗，滴加一抗（60ul），4℃过夜或37℃ 1～2h。
32. PBS冲洗，3′*3。
33. 除去PBS，滴加A增强剂，室温25′。
34. PBS冲洗，3′*3。
35. 除去PBS，滴加B剂，室温35′。
36. PBS冲洗，3′*3。同时配置DAB显色剂。
37. 除去PBS，DAB显色10′（在显微镜下观察染色程度控制染色时间）。蒸馏水冲洗。
38. 复染苏目素均匀滴加2滴，40′′，蒸馏水冲洗，60℃温水泡半分钟。
39. 脱水75%酒精→85%→95%→100%（3次），每级3′。
40. 透明二甲苯Ⅰ3′，二甲苯Ⅱ3′。
41. 封片中性树脂，加盖玻片（组织部位切勿残留小气泡），60℃ 0.5h烘干。
结果
棕褐色反应产物代表抗原X的定位。
拍照
42. 更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一次拍摄完全。特别是在拍摄过程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。
43. 数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈。特别要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉
44. 免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在250左右。如果呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不偏黄，也不偏蓝。