PathScan®夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）抗体配对方案

PathScan^®夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）抗体配对方案

A.     所需试剂:

1. 包被（缓冲）液：1X PBS，（20X PBS #9808）

3.2 mM Na₂HPO₄，0.5 mM KH₂PO₄，1.3 mM KCl，135 mM NaCl，pH 7.4

2. 漂洗（缓冲）液：1X PBS / 0.05% Tween-20，（20X PBST #9809）
3. 封闭（缓冲）液：1X PBS / 0.05% Tween-20，1% BSA
4. 1 X细胞裂解液：（10X Cell Lysis Buffer #9803）
   短时间内这种溶液可以放在4°C（1- 2个星期）
   注意：CST建议在使用前添加1mM苯甲磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF）

• 20 mM Tris (pH 7.5)
• 150 mM NaCl
• 1 mM ethylene diamine tetraacetate (EDTA)
• 1 mM ethylene glycol-bis(2-aminoethyl)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)
• 1% Triton X-100
• 2.5 mM sodium pyrophosphate  
• 1 mM β-glycerophosphate 
• 1 mM Na₃VO₄
• 1μg/ml leupeptin

5. TMB 底物：(TMB Substrate #7004)
6. 反应终止液：(STOP Solution #7002)

注意：这些试剂需现配现用。

B.      包被流程：

1. 用水漂洗微孔板。每孔加200 µl水然后倒掉。反扣在纸巾上务必将液体吸干。
2. 将捕获抗体按1：100用PBS稀释。为一块96孔板准备10 ml稀释抗体：在9.9 ml PBS中加入100 µl捕获抗体原液。混匀后，每个孔加100 µl。封好后4°C孵育过夜（17-20小时）。
3. 在包被过夜后，轻轻撕去封膜，清洗各孔：
   1. 将板中的溶液倒入废液缸中。
   2. 用漂洗液洗4次，每次每孔200µl。每次清洗时，将微孔板用力扣在干净纸巾上，弃净所有液体，但注意不要让微孔板完全干掉。
   3. 用无尘纸擦拭所有孔的外底面
4. 封闭微孔板。每个孔中加入150 µl封闭液，盖好板后37°C孵育2小时。
5. 封闭后，按步骤3洗板。洗好后微孔板就可以用了。

C.     制备细胞裂解物

1. 吸去培养基。换上添加有调节因子的新鲜培养基，处理所需时间。
2. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基并用冰冷的PBS漂洗一遍。
3. 除去PBS，每个10 cm盘中加入0.5 ml冰冷的含1 mM PMSF的1X细胞裂解液，冰上放置5分钟。
4. 将所有细胞刮下，转移至合适的离心管中。继续放在冰上。
5. 在冰上对样品进行超声处理。
6. 4°C离心10分钟，将上清转移到一个新管中。上清即为细胞裂解物。分装成足够一次使用的若干份保存在–80°C。

D.     测试流程：

1. 未稀释或在封闭液中稀释的细胞裂解物都可以用于实验。每孔加入100 µl细胞裂解物。盖上板并在37°C孵育2小时。
2. 洗板如涂覆操作第3步。
3. 将检测抗体1：100稀释在封闭液中。每块96孔板准备10 ml稀释抗体，在9.9 ml PBS中加入100 µl的检测抗体原液。混匀后，每孔加入100 µl。盖好板后37°C孵育1小时。
4. 洗板操作同包被流程第3步。
5. HRP偶联抗小鼠或抗兔的二抗用封闭液按1：1000稀释。每块96孔板准备10 ml稀释抗体，在9.99 ml PBS中加入10 µl的二抗原液。混匀后，每孔加入100 µl。盖好板后37°C孵育半小时。
6. 洗板操作如包被流程第3步。
7. 每孔加入100 µl T MB底物。盖好后37°C孵育10分钟。
8. 每孔加入100 µl STOP溶液。
9. 在适当的微孔读板仪上测定各孔在450 nm处的吸光值。