甲醇打孔的免疫荧光方法

甲醇打孔的免疫荧光方法

*重要提示：在开始实验前请查阅所用抗体的说明书中第一页应用（APPLICATIONS）部分，确认这支抗体已经验证过可用于你计划采用的本实验方法中的特定方案。

A.所需溶液和试剂

注意：用Milli-Q超纯水或是相当级别的水配制溶液。

1. 10 X磷酸盐缓冲液(PBS): 1升水中加入80 g 氯化钠 (NaCl), 2 g 氯化钾(KCl), 14.4 g 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) and 2.4 g 磷酸二氢钾 (KH2PO4)。调整pH到7.4。
2. 甲醛溶液，16%，无甲醇的类型， Polysciences, Inc. (cat# 18814) ，现配现用。开封以后放在4°C避光保存。使用时用PBS稀释。
3. 二甲苯
4. 无水乙醇，组织学级，100%和95%。
5. 蒸馏水(dH₂O)
6. 封闭缓冲液：配制25ml时，2.5 ml 10X PBS和1.25ml正常血清（来源与二抗相同，例如正常山羊血清，正常驴血清）兑到21.25ml的蒸馏水中，混匀。边搅拌边加入75µL Triton X-100(100%)。
7. 抗体稀释缓冲液  配置40ml时，取4 ml 10X PBS兑入36 ml蒸馏水，混匀。加入0.4 BSA，使溶解。边搅拌边加入120µL Triton X-100(100%)。
8. 10 mM 柠檬酸钠缓冲液  配置1L时，称取2.94g二水合柠檬酸三钠(C₆H₅Na₃O₇•2H₂O)溶解在1L蒸馏水中。调整pH为6.0。
9. 1X PBS, 高盐(0.4M) (高盐PBS)：配置1L时，取100ml 10X PBS兑入900 ml蒸馏水，另加23.38 g NaCl，使溶解。
10. 荧光素标记的二抗(推荐的二抗)

注意：第一次使用不论是一抗还是荧光素标记的二抗时，都需要做滴定分析以判断何种稀释比例能在你的样品上得到最强的特异信号同时背景保持最低。

11. Prolong^® Gold 抗淬灭试剂(Invitrogen, Eugene, OR, Cat# P36930)

B. 切片准备

I. 细胞系培养物来源(IF-IC)

重要提示：查阅说明书中APPLICATIONS部分，确认所用抗体可用于IF-IC。

注意：细胞应直接在多孔板，腔室玻片或是盖玻片上直接培养，处理，固定和染色。

1. 用PBS稍加润洗。
2. 吸去PBS，将细胞泡在2-3 mm厚的2-4%甲醛溶液（PBS配制）中。

注意：甲醛有毒，需要在通风橱中操作。

3. 室温下固定细胞15分钟。
4. 吸去固定剂，用PBS润洗三次，每次五分钟。
5. 甲醇打孔步骤 在甲醛固定后，将细胞浸泡在冰纯甲醇中（加入足量甲醇完全盖住细胞，液层厚度在3-5mm，千万别让细胞干掉），–20°C孵育10分钟。用PBS润洗5分钟。
6. 继续C部分的免疫染色。

II. 石蜡切片(IF-P)

重要提示：查阅说明书中APPLICATIONS部分，确认所用抗体可用于IF-P。

脱蜡处理/再水化

1. 用二甲苯浸洗切片3次，每次5分钟。
2. 用无水乙醇浸洗切片2次，每次10分钟。
3. 用95%乙醇浸洗切片2次，每次10分钟。
4. 在蒸馏水中润湿2次，每次5分钟。

抗原暴露：

1. 室温下，将切片泡在10 mM柠檬酸盐缓冲液中（pH 6.0.）。
2. 用水浴锅或是微波炉加热泡在柠檬酸盐缓冲液中的玻片使之接近沸腾，保持95-99°C约10分钟。
3. 取出玻片，放在实验台上自然冷却30分钟。
4. 在蒸馏水中润洗3次，每次5分钟。
5. 在PBS中润洗5分钟。
6. 继续C部分的免疫染色。

III. 冰冻切片(IF-F)

重要提示：查阅说明书中APPLICATIONS部分，确认所用抗体可用于IF-F。

1. 用PBS配置的2-4%甲醛溶液浸泡切片。

注意：甲醛有毒，这一步需要在通风橱中进行。

2. 室温下，固定15分钟。
3. 用PBS润洗3次，每次5分钟。

C.免疫染色

注意：以下所有的孵育过程，除特殊说明外，需要在室温下的避光湿盒中进行，以免切片变干和荧光淬灭。

1. 将样品在封闭液中封闭60分钟。
2. 封闭结束前，按说明书的指示用抗体稀释缓冲液稀释一抗。
3. 吸去封闭液，加入稀释的一抗。

注意：在做双染时，将两种抗体按各自合适的比例加入到抗体稀释缓冲液中配成混合液。

4. 在4°C孵育过夜。
5. 用PBS润洗3次，每次5分钟。

可选：为降低背景，在第2次PBS润洗和第3次BS润洗之间可增加高盐PBS润洗2分钟的步骤。但也要注意，这一步可能会降低一些抗体的特异信号。

注意：如果所用一抗直接标记有Alexa Fluor^®荧光素，则直接跳到C8步。

6.  把荧光素标记的二抗稀释在抗体稀释液中的，将样品与稀释抗体在室温下避光孵育1-2小时。

注意：在做双染时，将两种二抗体各自合适的比例加入到抗体稀释缓冲液中配成混合液。

7. 按第5步用PBS/高盐PBS润洗切片。
8. 涂上Prolong^® Gold抗淬灭试剂后盖上玻片。处理多孔板时，抗淬灭试剂盖住细胞细胞即可。
9. 在盖玻片的周围涂上指甲油密封。
10. 立即在显微镜下用相应波长激发光观察样品可以得到最佳的效果。如果要长期保存，将玻片放在4°C避光保存。

推荐的二抗

抗兔

• Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4412
• Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4413
• Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4414
• Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (DyLight™ 488 Conjugate) #4315

抗小鼠

• Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4408
• Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4409
• Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4410
• Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (DyLight™ 488 Conjugate) #4316

抗大鼠

• Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4416
• Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4417
• Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4418